生物大分子相互作用課件

1、生物大分子相互作用徐文弟2010.9.29分子生物學研究的重要領域遺傳中心法則基因表達調控細胞信號轉導 關于中心法則Genome(cells repertoire of DNA)Transcriptome(cells repertoire of RNA transcripts)Proteome(cells repertoire of proteins)單個基因單個細胞中心法則組學關于基因表達調控Regulation of Gene ExpressionChromatinepigenetic controlRNA silencingProteindegradation一般而言的基因表達調控范疇基

2、因轉錄調節(jié)基本要素（一）RNA聚合酶 (RNA Polymerase)（二）特異DNA序列 (cis-acting elements)（三）調節(jié)蛋白 (trans-acting factors)Gene expression regulation at the level of DNA (transcriptional regulation)-highly sequence-dependent-varied regulation for different genes順式作用元件：是決定真核基因轉錄活性的關鍵因素之一exon1intron1exon nintron n上游下游轉錄起始點增強子沉

3、默子啟動子TATA盒GC盒CAAT盒增強子反式作用因子和順式作用蛋白： 是真核基因的轉錄調節(jié)蛋白在真核細胞核中，有許多蛋白質能夠幫助RNA聚合酶轉錄RNA。這類蛋白質統(tǒng)稱轉錄因子（transcription factors，TF）或轉錄調節(jié)蛋白（transcription regulatory protein）。以反式作用方式調節(jié)基因轉錄的轉錄因子稱為反式作用因子（trans-acting factor），以順式作用方式調節(jié)基因轉錄的轉錄因子稱為順式作用蛋白（cis-acting protein） 。 真核基因的調節(jié)蛋白 反式作用因子 (trans-acting factor) 能直接或間接與

4、順式作用元件相互作用，進而調控基因轉錄的一類調節(jié)蛋白，統(tǒng)稱為反式作用因子。 按其功能不同，常有以下三類： 基本轉錄因子 :識別promoter元件 轉錄調節(jié)因子:識別enhancer或silencer 共調節(jié)因子：不能進行DNA-蛋白質相互作用RNA聚合酶在轉錄因子幫助下，形成的轉錄起始復合物polTFHTAFTFFTAFTAFTFATFBTBPTATA DNATAF: TBP associated factorsholoenzyme（1）基本轉錄因子 (general transcription factor) 能夠直接或間接與啟動子核心序列TATA盒特異結合、并啟動轉錄的一類調節(jié)蛋白。TB

5、P: TATA-box binding proteinTFII: pol II associated TF(2) 轉錄調節(jié)因子 (transcription factor, TF) 這類調節(jié)蛋白能識別并結合轉錄起始點的上游序列和遠端的增強子元件，通過DNA蛋白質相互作用而調節(jié)轉錄活性。決定不同基因的時間、空間特異性表達.轉錄激活因子(transcriptional activator)轉錄阻遏因子(transcriptional repressor)（3）共調節(jié)因子 (transcriptional regulator/ co-factor) 首先與轉錄因子發(fā)生蛋白蛋白相互作用，進而影響它們的

6、分子構象，以調節(jié)轉錄活性,本身無DNA結合活性。 如果與轉錄激活因子有協(xié)同作用共激活因子； 與轉錄阻遏因子有協(xié)同作用共阻遏因子。最常見的 DNA binding domain鋅指(zinc finger)C CysH His常結合GC box典型的類固醇激素受體結構示意圖堿性亮氨酸拉鏈轉錄激活蛋白與調控區(qū)DNA相結合的示意圖 堿性亮氨酸拉鏈（bZIP: basic Leu Zip)結構域轉錄激活因子序列比較 bHLH蛋白(basic Helix-Loop-Helix)同源域(Homeodomain)蛋白通過其第三個螺旋與雙鏈DNA的大溝相結合，其N端的延伸部分則與DNA的小溝相結合，提高了穩(wěn)定

7、性 關于細胞信號轉導細胞內存在復雜的信號轉導網絡信息轉導過程信號分子在細胞內的合成信號分子從發(fā)出信號的細胞釋放信號分子轉運至靶細胞靶細胞上的特異性受體識別信號分子靶細胞內信號轉導通路的啟動靶細胞的代謝、功能或分化改變信號分子的清除及靶細胞應答反應的終止 在細胞中，各種信號轉導分子相互識別、相互作用將信號進行轉換和傳遞，構成信號轉導通路（signal transduction pathway）。 不同的信號轉導通路之間發(fā)生交叉調控（crosstalking）形成復雜的信號轉導網絡（signal transduction network）系統(tǒng) 。蛋白激酶的逐級磷酸化是細胞信號通路的重要特征 MAP

8、K的逐級磷酸化是將膜受體接受的信號轉導至核內基因表達控制的重要環(huán)節(jié)，是細胞生長、分化和應激反應的共同信號通路蛋白質復合物：細胞信號轉導通路的結構基礎細胞中的各種蛋白分子不是獨立的，而是聚集在一起形成蛋白質復合體，共同完成各種生命活動。 EGFR介導的信號轉導過程生物大分子相互作用: 是信號轉導網絡控制基因表達的物質基礎信號轉導通路形成要求信號轉導分子之間可特異性地相互識別和結合，即蛋白質-蛋白質相互作用，這是由信號轉導分子中存在的一些特殊結構域介導的。這些結構域被稱為蛋白相互作用結構域（protein interaction domain）。 蛋白相互作用結構域特點 一個信號分子可以含有兩種以

9、上的蛋白質相互作用結構域，因此可以同時與兩種以上的其他信號分子結合； 同一類蛋白質相互作用結構域可存在于多種不同的分子中。這些結合結構域的一級結構不同，因此對所結合的信號分子具有選擇性，這是信號分子相互作用特異性的基礎； 這些結構域本身均為非催化結構域。 蛋白相互作用結構域縮寫識別模體Src homology 2 SH2含磷酸化酪氨酸模體Src homology 3 SH3富含脯氨酸模體pleckstrin homologyPH磷脂衍生物Protein tyrosine binding PTB含磷酸化酪氨酸模體WW WW富含脯氨酸模體蛋白相互作用結構域及其識別模體 銜接蛋白和支架蛋白：連接信號

10、通路與網絡銜接頭蛋白（adaptor protein）： 是信號轉導通路中不同信號轉導分子的接頭，連接上游信號轉導分子與下游信號轉導分子。發(fā)揮作用的結構基礎：蛋白相互作用結構域。功能：募集和組織信號轉導復合物，即引導信號轉導分子到達并形成相應的信號轉導復合物。大部分銜接蛋白的結構中只有2個或2個以上的蛋白相互作用結構域，除此以外幾乎不含有其他的序列。 銜接蛋白連接信號轉導分子基因表達與細胞信號轉導的偶聯(lián)機制Coupling of Gene Expression and Cell Signalning轉錄因子染色質相關蛋白RNA加工蛋白RNA轉運蛋白細胞周期蛋白細胞骨架NH2AAAAAm7GTr

11、anslation信號轉導網絡信號接收信號轉導 應答反應 細胞信號轉導的基本方式示意圖 影響轉錄共調節(jié)因子p300的信號通路 關于ATP合酶ATP合酶組成可旋轉的發(fā)動機樣結構 F0的2個b亞基的一端錨定F1的亞基，另一端通過和33穩(wěn)固結合，使a、b2和33、亞基組成穩(wěn)定的定子部分。部分和亞基共同形成穿過33間中軸，還與1個亞基疏松結合作用，下端與嵌入內膜的c亞基環(huán)緊密結合。c亞基環(huán)、和亞基組成轉子部分。 質子順梯度向基質回流時，轉子部分相對定子部分旋轉，使ATP合酶利用釋放的能量合成ATP。 關于陽性菌篩選 互補利用互補原理篩選重組體pUC18 關于生物大分子相互作用研究的關鍵技術酵母雙雜交技

12、術的基本原理46酵母單雜交技術的基本原理47酵母三雜交基本原理 生物大分子研究相關技術 隨著生命現(xiàn)象的研究逐漸由獲取基因序列信息轉向研究基因功能,一門新的學科蛋白質組學應運而生。 蛋白質組是一個在空間和時間上動態(tài)變化的整體,其功能往往是通過蛋白質之間或與核酸之間相互作用而表現(xiàn)出來的,這種相互作用存在于機體每個細胞的生命活動過程中,相互交叉形成網絡,構成細胞中一系列重要生理活動的基礎。 對于蛋白質相互作用的研究就成為蛋白質組學中最主要研究內容之一 迄今已發(fā)展了包括經典的噬菌體展示技術、酵母雙雜交系統(tǒng)以及新近發(fā)展并廣泛應用的串聯(lián)親和純化和熒光共振能量轉移技術、表面等離子共振技術等多種有效的研究蛋白

13、質間相互作用的高通量分析方法,為蛋白質組學的發(fā)展奠定了堅實的基礎。蛋白質相互作用研究當前進展1.利用蛋白質片段互補研究其相互作用和文庫篩選2.通過核糖體展示進行相互作用的體外篩選和進化3.利用膜上肽合成法分析蛋白相互作用4.蛋白質成束法增強其相互作用的檢測5.用計算方法分析全基因組蛋白質的相互作用6.通過蛋白質相互作用發(fā)展新的治療方法7.利用核磁共振法分析蛋白質相互作用蛋白質相互作用的實驗技術標簽融合蛋白（Labeled fusion protein）免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）酵母雙雜交（Yeast two hybrid system）熒光共振能量轉移技術（FR

14、ET）表面等離子共振技術（Biacore SPR）原子力顯微鏡技術（Atomic force microscopy）噬菌體展示技術（Phage display）免疫共沉淀熒光共振轉移技術噬菌體展示技術酵母雙雜交技術基因外抑制子合成致死篩選分子生物學方法親和印跡Pull down 試驗遺傳學方法蛋白質相互作用研究方法生物物理學方法酵母雙雜交系統(tǒng)( Yeast two2hybrid system,Y2H) 酵母雙雜交系統(tǒng)( Yeast two2hybrid system,Y2H)是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白質,到現(xiàn)在,雙雜交系統(tǒng)已經成為檢測和鑒定蛋白質相

15、互作用的標準方法,并且在旨在建立一系列蛋白質相互作用關系的蛋白質組研究中扮演著重要角色。 Y2H的建立是基于人們對酵母半乳糖苷酶基因的轉錄激活因子GAL4的詳細了解。GAL4包括兩個可以獨立的結構域: N 末端的DNA 結合域(DNA2binding domain,DNA2BD)和C末端的轉錄激活域( Transcrip tion activating domain, DNA2AD ) 。DNA2BD可以與DNA 分子的上游激活序列結合,DNA2AD則可以激活下游基因的轉錄,只有當兩者在空間上充分接近時才會共同作用激活轉錄活性。 雙雜交技術正是利用了GAL4的這一特點,將欲研究的兩個目標蛋白的

16、編碼序列分別與GAL4的結合域和激活域的編碼序列融合,構建成兩個雜交系統(tǒng);再將這兩個雜交系統(tǒng)共同轉化至含有報告基因的酵母細胞株;若兩個目標蛋白發(fā)生相互作用,則會使DNA - BD和DNA - AD在空間上靠近進而激活報告基因的表達。 酵母雙雜交系統(tǒng)簡單快速,最常用于鑒定與已知蛋白相互作用的未知蛋白,同時也是發(fā)現(xiàn)新的蛋白質相互作用以及確定相互作用結構域的重要研究手段。 TRPC通道是一組Ca2 +流量調節(jié)通道蛋白,研究證明磷脂酶C1 (phospholipase C1, PLC21)結合并控制該通道,對降低Ca2 +流量是必要的,但一直沒有鑒定出它們相互作用的結構域。 Rossum等人應用Y2H

17、系統(tǒng),構建了pGBKT72BD2TR2PC3和pGADT72AD2 PLC21兩個載體,共同轉化到酵母當中,以Lacz為報告基因,發(fā)現(xiàn)PLC21只特異的與TRPC3相結合。實驗人員又構建了載有不同氨基酸長度TRPC3 與PLC21的雙雜交系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)TRPC3與PLC21的相互作用只依賴于TRPC3中對應的PH相似結構域中4046個氨基酸,從而建立了一個廣泛的信號轉導模型。融合蛋白pull-down實驗 融合蛋白pull-down技術基本原理是將一種蛋白質固定于某種基質上(如Sepharose),當細胞抽提液經過該基質時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有被吸附的“雜質”則隨洗脫液流

18、出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或洗脫條件而回收下來。 為了更有效地利用pull-down技術，可以將待純化地蛋白以融合蛋白地形式表達，即將“誘餌”蛋白與一種易于純化地配體蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽S轉移酶（glutathione-S-transferase ,GST）融合標簽從細菌中一步純化出GST融合蛋白。從此GST融合蛋白在蛋白質相互作用研究領域里得到極大的推廣。 GST融合蛋白在經過固定有GST(glutathione)的色譜柱時，就可以通過GST 與GSH的相互作用而被吸附。當再有細胞抽提物過柱，就可得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的興趣蛋白。 一般來說GST融合

19、蛋白pull-down方法用于兩個方面： 一、鑒定與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質 二、鑒定兩個已知蛋白質之間是否存在相互作用洗脫（2）結合（3）檢測（6）收集（5）洗脫（4）固定誘餌蛋白（1）噬菌體展示 噬菌體展示技術是在深刻理解噬菌體遺傳學和生理學特性的基礎上產生的。 其原理是將蛋白質文庫整合到一個簡單的噬菌體顆粒中，利用目的蛋白質與特異配基的親和力，篩選和配基特異結合的蛋白質。 噬菌體展示技術一般要經過多輪的篩選，這樣就可以得到在文庫中含量很低的與配基特異作用的蛋白質。 噬菌體展示技術 Phage display techniques, PDT 大腸桿菌絲狀噬菌體包括f1、fd和M13

20、,它們只感染含F(xiàn)因子的大腸桿菌。1985年,美國Missouri大學Smith博士等人將R I核酸內切酶基因片段連接到絲狀噬菌體fd編碼次要外殼蛋白的基因中,成功地得到了在外殼蛋白中融合表達了酶分子的噬菌體顆粒。 后經驗證,該噬菌體能被EcoR核酸內切酶抗體有效中和,說明展示在噬菌體外殼表面的酶分子具有與天然酶分子相同或極其相近的構象和活性,這一試驗的成功標志著噬菌體展示技術的誕生。 噬菌體展示技術是在噬菌體展示肽庫建立之后才開始廣泛應用到蛋白質相互作用研究的。 1990年Scott等人利用噬菌體展示技術構建了隨機多肽文庫,該文庫由特定長度的隨機短肽組成,理論上包含了某一固定長度短肽所有氨基酸

21、的排列組合方式。 由于蛋白質間的識別與結合主要取決于局部肽段中少數(shù)幾個氨基酸,所以用受體蛋白對隨機肽庫進行親和篩選,就能得到之結合的短肽序列,根據(jù)此短肽的序列,就可以得到與目的蛋白相互作用所依賴的氨基酸殘基,從而可以進一步研究蛋白質之間的分子識別,酶與底物的結合等。 突破了傳統(tǒng)研究蛋白質相互作用時需對其結構詳盡了解的限制。絲狀噬菌體蝌蚪形噬菌體噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體M13噬菌體 噬菌體展示技術最大的特點在于被展示在噬菌體表面的多肽或蛋白質可保持相對獨立的空間結構和生物活性,建立起了基因型和表現(xiàn)型之間的一致性。 到現(xiàn)在已相繼成功構建了f1、M13、T4 等噬菌體表達載體,為蛋白質組學的發(fā)

22、展提供了有利的工具。 Jespers等利用噬菌體展示技術,通過熱變性發(fā)展了一種選擇抗凝集蛋白的方法,這一方法的建立對于抗凝集蛋白的選擇、鑒定;防止或促進蛋白的凝集反應以及診斷由凝集蛋白引起的疾病等方面都意義重大。串聯(lián)親和純化Tandem affinity purification , TAP 串聯(lián)親和純化( TAP) 1999年Rigaut等人共同提出了一套分離復合蛋白的新方法串聯(lián)親和純化( Tandem affinity purification , TAP) ,兼具標準親和純化和免疫共沉淀兩種生化方法的優(yōu)點,為蛋白質復合體的分離鑒定提供了一條新路徑。 串聯(lián)親和純化技術原理 串聯(lián)親和純化技術

23、首先需通過基因工程給被分離純化蛋白的一端加一個TAP標簽,該標簽由IgG結合結構域( ProtA ) 及一個鈣調蛋白結合多肽(CBP)組成,結構域與多肽之間由一個TEV蛋白酶切位點隔開。 通過基因重組將細胞內源性的目標蛋白基因置換為帶有TAP標簽的基因。 溫和裂解細胞,獲取細胞抽提物,將抽提物加入IgG親和柱,TAP標簽的ProtA端會與IgG形成強結合,在用洗脫液洗脫掉大部分非特異性結合物和雜蛋白后,再用含有TEV蛋白酶的洗脫液將蛋白質復合體切割下來。 在鈣離子參與下,被切割下來帶有CBP的蛋白質復合體與鈣調蛋白緊密結合,充分洗脫,就可以進一步去除非特異作用的蛋白質雜質,最后純化出高純度的目

24、的蛋白復合體。 利用串聯(lián)親和純化技術,通過對洗脫后的復合體作質譜分析或電鏡觀察,可以快速的發(fā)現(xiàn)細胞中新的蛋白質復合體或鑒定出復合體中的新組分。TAP親和層析純化原理 TAP親和層析純化應用實例 Dziembowski等人應用TAP技術,純化分析了釀酒酵母(Saccharom yces cerevisie)前體mRNA拼接酶復合體2U2微小核糖核蛋白顆粒( small nuclear ribo2nucleop rotein particle, snRNP)關聯(lián)拼接因子SF3a和SF3b。在對SF3b的純化中分離出了一個新的重要的蛋白亞基Ysf3p。 按照先前的觀點,認為在酵母SF3b中存在一個S

25、nu17p亞基,是人類SF3b因子中p14 亞基的直系同源物, 在此次試驗中卻發(fā)現(xiàn)Snu17p不屬于酵母SF3b因子,而是屬于本實驗中新發(fā)現(xiàn)的另一個拼接酶復合體RFS的一個組分。免疫共沉淀coimmunoprecipitation 非變性裂解完整細胞時，胞內許多蛋白質間的結合狀態(tài)可以保持下來。如果蛋白質X用其抗體免疫沉淀，則在細胞內與X穩(wěn)定結合的蛋白質Y也能沉淀下來。 蛋白質Y的沉淀是基于與X的物理性相互作用，被稱為免疫共沉淀。 該技術在實際應用中常用融合表達的帶有蛋白標簽的特異性抗體與目標蛋白質或蛋白復合物結合，形成蛋白復合物沉淀。將蛋白質復合物溶解，再通過對蛋白標簽具有特異吸附作用的親和色

26、譜柱將蛋白復合物分離純化出來, 進而通過凝膠電泳或質譜等技術鑒定分離的蛋白。 該方法常用來確定生理條件下目的蛋白在細胞或組織內是否存在與其相互作用的蛋白質。 免疫共沉淀法的優(yōu)點是，所研究的相互作用蛋白均是經翻譯后修飾的天然蛋白，可以表征生理條件下蛋白質間的相互作用。 但該方法需首先針對目標蛋白，制備出一定量的多克隆或單克隆抗體，過程相對復雜。同時，目的蛋白質只有達到一定濃度才能與抗體結合形成沉淀，因而該法只適用于研究具有高表達量的目標蛋白，應用范圍有較大局限。 Dugan等利用該技術確定了細胞周期中cMyc和E2F兩個轉錄因子間的相互作用。蛋白質片段互補分析（protein fragment

27、complementation analysis，PCA） 泛素蛋白可以分為兩個片段，將編碼這兩個片段的基因分別與編碼“誘餌”蛋白和“獵物”蛋白的基因在胞質內進行融合表達，如果“誘餌”蛋白和“獵物”蛋白發(fā)生相互作用，則泛素蛋白的兩個片段得到重組而形成完整的泛素蛋白。 在泛素蛋白的介導下，作為泛素蛋白介導酶底物的報告蛋白被酶解，通過檢測報告蛋白的含量變化監(jiān)測蛋白質間的相互作用。 除泛素蛋白外，腺苷酸環(huán)化酶和氨基酸異構酶也可作為片段蛋白。 蛋白質片段互補技術也已成功應用于膜蛋白相互作用的系統(tǒng)化研究。以上方法是通過間接監(jiān)測報告蛋白特性的改變來鑒定蛋白質相互作用，容易產生假陽性結果?，F(xiàn)在通過將熒光蛋白

28、等報告蛋白作為蛋白互補片段與“誘餌”蛋白和 “獵物”蛋白融合表達，可通過直接監(jiān)測熒光蛋白特性的改變來鑒定蛋白質相互作用。該種方法更為直接，減少了泛素蛋白介導酶解過程中的假陽性反應 。 該技術常用于檢測環(huán)境因素或激素介導的蛋白質相互作用。 Westwick等用該技術從時間和空間兩方面研究了Ras蛋白（一類GTP結合蛋白）與其調節(jié)因子及效應因子間的相互作用，為藥物治療Ras蛋白相關信號傳導疾病指明了方向。 相對于酵母雙雜交技術，蛋白質片段互補分析技術準確率較高，假陽性率較低，且能檢測任何細胞類型的體內和體外的蛋白質相互作用。但該技術對融合蛋白的設計和表達要求較高。 化學交聯(lián)法chemical cr

29、oss linking 化學交聯(lián)是共價連接不同化學功能基團的技術，是對蛋白質化學修飾的簡單延伸。蛋白質的親核側鏈和多肽鏈末端的活性氨基酸可與化學交聯(lián)劑發(fā)生化學交聯(lián)反應。相互作用的蛋白質是彼此結合或靠近的，可選擇合適的化學交聯(lián)劑，通過化學交聯(lián)反應得到蛋白交聯(lián)復合物，再利用蛋白質電泳或放射自顯影等技術，即可鑒定出彼此間有相互作用的蛋白質。 化學交聯(lián)法可以檢測到很微弱的相互作用以及難溶的蛋白質（如膜蛋白）之間的相互作用，還可以使蛋白復合物鎖定在某一特定構象，進而獲取相對的和絕對的結構信息。 化學交聯(lián)法適于研究能夠形成穩(wěn)定復合物的蛋白質間的相互作用。但化學交聯(lián)法受交聯(lián)劑種類、濃度,反應時間、溫度及pH

30、值等條件的影響較大，條件優(yōu)化過程繁雜，這在一定程度上限制了該技術的應用。 Dey等已利用該方法成功研究了大腸桿菌L7/L12蛋白與其延長因子的相互作用,并確定了個活性結構域。蛋白質芯片protein microarray 蛋白質芯片技術，是DNA芯片技術的擴展，即在固體支持物表面高密度地固定化排列探針蛋白點陣，以特異地捕獲樣品中的靶蛋白，然后通過檢測器對靶蛋白進行定性或定量分析。 蛋白質芯片技術主要用于進行自動化分析，支持高通量快速篩選。蛋白質芯片能夠同時高效地分析上千種蛋白質間的相互作用,也使得在全基因組水平研究蛋白質的功能(如酶活性、抗體特異性配體、受體交互作用)成為可能。但該項技術的使用

31、受到了蛋白質固定化技術以及載體材料選擇的限制，同時也需要復雜昂貴的儀器來對樣品進行預處理和檢測。 何為等通過固定規(guī)模化制備的多種抗體制作成抗體微陣列芯片，通過與熒光標記的人球蛋白和人白蛋白的相互作用,實現(xiàn)了高通量地對不同抗體株抗球蛋白和抗白蛋白活性的快速篩選與比較?？贵w芯片 蛋白芯片技術的出現(xiàn)給蛋白組學研究帶來新思路。蛋白組學研究中一個主要的內容就是要研究在不同生理狀態(tài)或病理狀態(tài)下蛋白水平的量變。 微型化，集成化，高通量化的抗體芯片就是一個非常好的研究工具，它也是蛋白芯片中發(fā)展最快的芯片，而且在技術上已經日益成熟。 這些抗體芯片有的已經在向臨床應用上發(fā)展，比如腫瘤標志物抗體芯片等，還有很多已經

32、用在研究的各個領域里。 第一張商品化的抗體芯片是由美國BD Clontech公司推出的。 這是一張用于研究的抗體芯片，芯片上排列了378種已知蛋白的單抗（Ab Microarray 380， 目錄號 K1847-1），這些單抗對應的蛋白都是細胞結構和功能上十分重要的蛋白，涉及信號傳導、腫瘤、細胞周期調控、細胞結構、細胞凋亡和神經生物學等廣泛的領域。通過這張芯片，我們在一次實驗中就能夠比較幾百種蛋白的表達變化。 微量熱技術（microcalorimetry） 微量熱法分為： 等溫滴定量熱（isothermal titration calorimetry,ITC） 差示掃描量熱(different

33、ial scanning calorimetry,DSC) 其中等溫滴定量熱法可以用來研究蛋白質的相互作用，實驗中通過將可能有相互作用的蛋白質溶液進行互相滴定。 每次滴定后，反應熱放出或吸收，可以被ITC所檢測到，檢測到的熱效應的熱力學分析提供了相互作用的相關能量過程的定量特征，可以直接測量常溫下發(fā)生相互作用過程中完整的相關的熱力學數(shù)據(jù)，如結合常數(shù)（Ka）、結合位點數(shù)（n），結合焓（H）、恒壓熱容（Cp）和動力學數(shù)據(jù)（如酶促反應的Km）,進而分析蛋白質間的相互作用。 等溫滴定量熱法常用于獲取蛋白質間相互作用的完整的熱力學信息。 微量熱法能通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續(xù)、準確地監(jiān)測和記錄

34、一個變化過程的量熱曲線，原位和在線和無損傷地同時提供熱力學和動力學信息。 Jacobson等用等溫滴定量熱法研究了人細胞RNA聚合酶轉錄因子TFIID的最大亞單位TAFII250的組蛋白乙酰基轉移酶活性。等溫滴定量熱法靈敏度較高，能測量到的熱效應最低可達125 nJ，最小可檢測熱功率2 nW，蛋白樣品最小用量0.4 g，響應時間小于10 s，但該法對樣品純度要求較高。原子作用力顯微技術（atomic force microscopy, AFM） 原子作用力顯微技術是在掃瞄隧道顯微技術的基礎上發(fā)展起來的。AFM通過力掃描方式，以單分子水平的高分辨率測量蛋白質間的相互作用力。 如在配體受體間相互作

35、用力的研究中，配體被固定于AFM的彈性懸臂表面，受體被固定于適當?shù)幕妆砻妫趹冶劢咏碗x開基底的過程中，通過懸臂的偏折便可測得配體受體間的作用力。 該技術常用于直接檢測蛋白復合物解體期間的動力強度及自由能變化。原子作用力顯微技術能直接有效地檢測在外力作用下，蛋白質分子機械性質的改變。由于該技術常受到非特異結合力的干擾，導致結果誤差較大。 Yuan等用該技術測得鏈霉抗生物素蛋白與生物素之間的結合力在115170 pN之間。熒光共振能量轉移( Fluorescence resonance energy transfer,FRET) 熒光共振能量轉移是近年來迅速發(fā)展的一種新技術,其最大的特點就是可

36、以在活體細胞生理條件下對蛋白質間的相互作用進行實時的動態(tài)研究,已成為現(xiàn)代蛋白質組學研究的有力工具。 一對合適的熒光物質構成一個能量供受體對時,能量在它們之間可以發(fā)生轉移。 1948 年Frster提出的這一熒光共振能量轉移理論奠定了FRET技術的理論基礎。 1992 年, Prasher等首次從維多利亞水母中分離并克隆了一種熒光物質綠色熒光蛋白( green fluorescent p rotein, GFP) 。 隨后, Heim等通過點突變等方式,得到了多種熒光光譜不同的熒光蛋白,如藍色熒光蛋白( blue fluorescence p ro2tein ,BFP) ,黃色熒光蛋白( yel

37、low fluorescence p ro2tein , YFP) 和藍綠色熒光蛋白( cyan fluorescence p rotein, CFP ) 等, 提供了大量的能量供受體, 為FRET技術提供了現(xiàn)實基礎。 目前FRET技術中常用的熒光蛋白對是YFP和CFP,當與熒光基團融合的被研究蛋白發(fā)相互作用時,熒光基團在空間上靠近,發(fā)生能量轉移,通過檢測供受體分子發(fā)射程度比率的變化就可得知蛋白質結合程度的強弱。 目前, FRET技術已在檢測酶活性變化、膜蛋白的研究、信號轉導、細胞周期調控等研究中發(fā)揮了重要作用。 例如在細胞凋亡相關蛋白的研究中,天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶在細胞凋亡的執(zhí)行期發(fā)

38、揮關鍵的作用。Reiko等利用FRET技術研究了Caspase8與其底物Bid蛋白質間的相互作用,將Bid蛋白兩端分別與CFP和YEP融合,精心設計使其在沒有被酶裂解前剛好可以發(fā)生共振能量轉移,當Bid蛋白被裂解后,能量轉移效應自然消失,從而很好的檢測了Caspase8酶的活性。表面等離子共振( Surface plasmon resonance, SPR) 表面等離子共振是數(shù)理科學與生物學相互滲透、結合而產生的一種全新的研究生物大分子之間相互作用的方法,近幾年在生物技術領域得到了廣泛的應用。 表面等離子共振( Surface plasmon reso2nance, SPR)是一種物理光學現(xiàn)象

39、,當一束平面單色偏振光以一定角度入射到鍍在玻璃表面的薄層金屬膜上發(fā)生全反射時,若入射光的波向量與金屬膜內表面電子的振蕩頻率相一致,光線即被耦合入金屬膜引發(fā)電子共振,即表面等離子共振。由于共振的產生,導致反射光的強度在某一特定的角度大大減弱,反射光消失的角度稱為共振角( SPR angle) ,共振角隨金屬表面折射率的變化而變化,而折射率的變化又與金屬表面結合物的分子質量成正比。 在20世紀90年代發(fā)展了應用SPR原理檢測生物傳感芯片( biosensor chip ) 上的配位體與分析物作用的一種新技術表面等離子共振。 在該技術中,待測生物分子被固化在生物傳感芯片上,使另一種被測分子的溶液流過

40、表面,如二者發(fā)生相互作用,就會引起芯片表面折射率的變化,從而導致共振角的改變,通過檢測該共振角的變化,就可實時監(jiān)測分子間的相互作用。 1992 年, Fagerstam 等首次將此技術用于生物特異相互作用分析( biospecific interaction analysis , BIA) 之后,由于該技術快速、安全、無需標記以及高靈敏度等特點,已被廣泛用于分析生物分子如蛋白質間、蛋白質與核酸、核酸之間的相互作用,涉及免疫識別、信號傳導、藥物篩選和蛋白質構象變化等多個研究領域?；谟嬎惴治龊蜆嫿ㄏ嗷プ饔媚Ｐ偷姆椒?全基因組計算分析法（analysis of genome wide protei

41、n interactions by computational approaches） 基因組中的基因和蛋白質組中的蛋白具有遺傳和翻譯的上下對應關系。因此，可以從完整的基因組序列獲取更多的蛋白質遺傳翻譯信息，包括基因本身及位置的保守性、基因組內的基因融合分析、代謝重建及基因共調控等。 基于以上信息，運用大規(guī)模高效的數(shù)值計算和理論模型來識別基因組序列中代表蛋白質的編碼區(qū)，破譯隱藏在核酸序列中的遺傳語言規(guī)律，可以獲知蛋白質復合物的形成以及蛋白質在代謝和信號通路中的直接或間接作用。 該法的特點是：充分整合了基因組和蛋白質組的研究信息，能夠有效預測相關的蛋白質相互作用，指導蛋白質相互作用的實驗研究。

42、但該方法必需和具體的實驗技術結合，才能確認不同蛋白質間的相互作用。如Uetz等利用全基因組計算分析法，耦合酵母雙雜交技術準確鑒定出了啤酒酵母細胞中的957種蛋白質相互作用。構建相互作用模型法（integrate networks and models） 人們在研究蛋白質相互作用的同時，也建立了多種蛋白質相互作用數(shù)據(jù)庫，基于合理的運算程序，有效地整合分析實驗數(shù)據(jù)，建立蛋白質相互作用網絡模型。 該方法可以對參與和調節(jié)某個生理過程的各種蛋白質間的相互作用進行有效系統(tǒng)研究，進而研究代謝、信號傳導、遺傳調控等調節(jié)生命活動的重要功能途徑。 如Ideker等基于GraphWin程序，將Schwikowski

43、等給出的酵母細胞中2709對蛋白質相互作用數(shù)據(jù)進行分析整合，繪制出相互作用網絡圖，進而從中發(fā)現(xiàn)Gal4p、Gal11p和Gal80p三種蛋白質間的相互作用調控著酵母中半乳糖代謝途徑中的多個重要進程。 相關數(shù)據(jù)庫生物分子相互作用網絡數(shù)據(jù)庫（BIND） 蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫（DIP）蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫的JSP鏈接http:/point.bioinformatics.tw/intro/intro.jsp DNA與蛋白質相互作用研究方法研究技術新進展 隨著分子生物學和生物技術的迅猛發(fā)展,傳統(tǒng)的生物化 學和物理化學研究方法已不能滿足現(xiàn)有的實驗要求,分子生物化學家們力求建立和發(fā)展更為有效、靈敏、快速和精確的

44、鑒定 DNA - 蛋白質相互作用的方法。 核酸適體技術、熒光技術、掃描探針顯微鏡技術、等離子共振技術、質譜技術和分子模擬等先進手段應運而生,并促進該研究領域沿微觀方面發(fā)展。 目前對以蛋白質為主的生物大分子的研究已經進入了一個新的層次。其重要特點不再是滿足于對單一生物大分子的研究，而是綜合各種分析方法來研究一個完整的生物學途徑或一個細胞或細胞器中蛋白質、核酸、多糖等分子之間識別和相互作用的機制。其中DNA與蛋白質間相互作用參與許多生物學過程。92酵母單雜交技術的基本原理酵母單雜交技術yeast one hybrid system該技術是由Li J J 和Herskowitz 從酵母雙雜交技術發(fā)展

45、 來的。通過對酵母細胞內報告基因表達狀況的分析,來鑒定DNA 順式作用元件和轉錄因子的結合情況;通過篩選DNA 文庫,來獲得與靶序列特異結合的蛋白質基因序列。其原理是:根據(jù)大多數(shù)轉錄因子含有DNA 結合結構域(DNA - binding domain ,BD) 和轉錄激活結構域(activation domain ,AD) ,且兩結構域可完全獨立地發(fā)揮作用的特點,來設計攜帶有編碼“靶蛋白”的文庫質粒,從而使文庫蛋白編碼基因置換酵母原有轉錄因子GAL4 的DNA 結合結構域,并通過表達的“靶蛋白”與目的基因相互作用來激活RNA 聚合酶,啟動下游報告基因的錄。該系統(tǒng)需包含: 將文庫蛋白的編碼基因與

46、 GAL4 轉錄激活域融合表達的cDNA 文庫質粒; (2) 含目的基因與下游報告基因的報告質粒。 其中,文庫的設計和篩選實驗是整個酵母單雜交系統(tǒng)的核心技術。 酵母單雜交系統(tǒng)已被用于克隆多種重要的DNA 結合蛋白,該系統(tǒng)相對直接、快捷、靈敏,篩選到的蛋白是在體內相對天然條件下有結合功能的蛋白質,比其他體外技術獲得的結果更能體現(xiàn)真核內基因表達調控的真實情況,且無需復雜的蛋白質分離純化操作。但因細胞技術的先天局限性和所用報告基因His3 或lacZ的自泄漏表達等缺陷,在實際操作中常出現(xiàn)漏檢和假陽性現(xiàn)象。 DNA-蛋白質印跡雜交 主要用于調控蛋白與調控元件相互作用的研究，是根據(jù)位點特異性結合蛋白借助

47、于氫鍵、離子鍵和疏水鍵與同位素標記的特異序列探針結合，通過放射自顯影體系對 結合蛋白進行定性、定量及對基因組結合序列進行定位分析的一種方法。DNase足跡法DNase footprinting 常用于體外DNA - 蛋白質相互作用的鑒定。該方法于1978 年引入科研領域,其原理與DNA 的化學測序法相似,即用DNase 部分消化已進行單鏈末端標記的待測雙鏈DNA ,形成在變性聚丙烯酰胺凝膠上以相差一個核苷酸為梯度的DNA 條帶。 當DNA片段與其特異性結合的蛋白結合后,DNA 結合蛋白就阻礙DNase 在結合位點及其周圍部位的結合,形成切割梯中的空白區(qū)域,結合DNA 化學測序法,就可知該結合區(qū)

48、的堿基序列。 該技術在實際操作中涉及了有機抽提、離心等蛋白純化步驟, 較為繁雜,因此在該足跡法的基礎上又發(fā)展了固相DNase 足跡法 ,它具有如下優(yōu)點采用生物素進行末端標記,避免放射性同位素的摻入,減少危害; (2) 省略了有機抽提、沉淀等蛋白純化步驟,操作簡便,效率高;(3) 使用范圍廣,可適用于未經純化的核蛋白粗提物內特異性DNA 結合蛋白的研究。 凝膠阻滯電泳 該方法是一種簡單、快速檢測DNA結合蛋白的方法。 在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳中DNA和蛋白質的復合物的遷移速度比單一的DNA片段或雙鏈的寡核苷酸要慢。免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation ana

49、lysis , ChIP) 其原理是在活細胞狀態(tài)下利用甲醛或其他交聯(lián)劑固定蛋白質- DNA 復合物,經超聲破碎、特異性抗體沉淀復合體,后解除偶聯(lián)、純化目的片段并檢測等步驟來獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。 ChIP能捕捉到發(fā)生在染色質水平上的基因表達調控的瞬時事件,如實、完整地反映DNA 與蛋白質的動態(tài)結合 ,但該方法尚存些不足,如:難以同時得到多個因子對同一序列結合的信息,或目標蛋白不是直接地與染色質結合 等。 近年來,研究者不斷地發(fā)展和完善此技術,建立了廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選的CHIP - chip (芯片)方法和研究RNA 在基因表達調控中的作用的RNA - CHIP方

50、法等。 該技術在國外已得到廣泛應用,但在國內尚未成熟應用。 SELEX技術 適配分子技術是一種最近發(fā)展起來的體外篩選和放大技術，通過該技術可得到一段能與各種目標分子高親和、高特異結合的核酸序列，該核酸序列稱之為適配分子(aptamer)。 Aptamer一詞來源于拉丁文Aptus，意即適合的意思(fit)，而這種體外的篩選技術稱之為指數(shù)級富集配體系統(tǒng)進化技術即SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)。 簡言之，Aptamer就是一段核酸序列，它能與相應的配體高特異性和高親合力地結合。從原始文庫中篩選配體相應

51、的Aptamer的技術稱為SELEX技術。 Aptamer具有廣泛的實用性，它能用于任何以分子識別為基礎的診斷和治療。原理 從大量的隨機序列的寡核苷酸庫中鑒定出一種數(shù)量很少的具有獨特性質的核酸序列的方法是由Tuerk和Ellington等在1990年建立的，它是一種通過體外反復選擇和放大從核苷酸組合庫中篩選特定核苷酸序列的方法。 SELEX過程中，首先是用組合化學合成DNA的方法合成隨機序列的核酸庫，庫中的每一個成員是一個線形的寡聚物，庫中分子多樣性的程度取決于隨機寡核苷酸的長度。 理論上講，一個40個堿基的隨機序列可有1.2 X 1024種核苷酸排列順序(440 =1.2 X 1024)。實

52、際上1mol的固相DNA合成的隨機組合核苷酸庫的序列多樣性僅限制于10141015種，能否找出與靶分子相互作用的稀有序列，很大程度上取決于組合庫的多樣性，在所有種類的組合隨機序列庫中寡核苷酸庫的多樣性最為豐富。 篩選過程中，首先在一定的溫度下將寡核苷酸隨機序列庫與靶分子共同孵育于特定的緩沖液中，組合庫中的極少數(shù)分子將與靶分子結合，然后用物理的方法將結合的分子與末結合的分子分離開來。標準的方法是將蛋白靶分子固定于硝酸纖維素濾膜上，而其他小的靶分子則固定于固相載體的表面，因此，未與靶分子結合的序列很容易被沖洗掉，而與靶分子結合的序列將被分離出來并放大以獲得一個序列庫，再對這一序列庫進行下一輪的篩選

53、和放大。SELEX技術原理 由于aptamer 具有精確識別、易體外合成與修飾等特性，SELEX 技術在分析化學、基因調控、蛋白質組研究、疾病治療與新藥研發(fā)等方面得到廣泛的應用。 更重要的是，aptamer 的靶分子范圍很廣，與靶分子間的親和力和特異性更高，從SELEX 技術建立至今，SELEX 技術和aptamer 的研究不斷受到新的挑戰(zhàn)與更新。SELEX與核酸適體技術其篩選過程包括: 體外合成單鏈寡核苷酸序列的隨機文庫; 在適宜條件下,孵育單鏈寡核苷酸庫與靶蛋白形成DNA - 蛋白質復合物; 分離未與靶蛋白結合的寡核苷酸; 解離與靶蛋白結合的寡核苷酸,以此為模板進行PCR 擴增,得到特異結

54、合的寡核苷酸庫,再進行下輪的篩選過程; 通過反復篩選與擴增,得到親合力強于抗原抗體之間的高特異核酸適體。SELEX 技術至問世來就以驚人的速度發(fā)展,因其庫容量大、特異性高、親和力強等優(yōu)點,在靶物質的篩選上得到了廣泛應用,也為DNA - 蛋白質相互作用研究提供了一 種新穎的研究方法。用于DNA - 蛋白質相互作用研究的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment ,SELEX)是一種新型的體外篩選技術,它以DNA 與蛋白質相互作用為基礎建立隨機寡核苷酸文庫,從中篩選到能與各種配體(靶蛋白) 特異性結合的單

55、鏈寡聚核苷酸片段, 長度一般為20 40bp ,該寡核苷酸片段就稱為核酸適體(aptamer) 。 核酸適體技術已成為適配體篩選的有效工具,其所結的靶分子范圍非常廣泛,除蛋白質之外,還可以是酶、核酸、細胞黏附分子、植物凝集素、病原菌、有機物甚至是金屬離子等,且篩選到的適配體能識別單抗不能區(qū)分的蛋白質。 基于這些特性,核酸適體技術已在基礎研究、臨床診斷、藥物篩選、生物傳感器等領域應用。 SELEX 技術是體外實驗,其篩選到的核酸適體所表現(xiàn)出的一些優(yōu)良性質,在體 內實驗中可能會完全失效;核酸適體與靶分子的非特異性結合及適配體的同源性、親和力等的影響,造成了SELEX的前期篩選工作的復雜性。這也是SELEX 技術亟待解決的兩個問題。如果完成適配體的各種有效修飾及安全的藥物評價模型的構建,SELEX技術存在的問題也將逐步解決。 熒光技術 該技術已廣泛用于生物分子之間的相互作用研究。由于核酸及其鏈上的堿基的熒光產率很低,蛋白質組成里也只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有天然熒光,所以采用“內源熒光”的分析方法受到了很大的限制。 用于研究DNA - 蛋白質相互作用的熒光法,主要是將熒光物質修飾到蛋白質或核酸分子上構成新型熒光標記物質并結合相關儀器而改造成新型的檢測技術。它對待測物質的濃度要求低,靈敏度高且部分熒光技術可實現(xiàn)對待測物質的動態(tài)