組織學(xué)制片技術(shù)(本科)課件

1、組織病理學(xué)常用技術(shù)基本理論第2節(jié)、第3節(jié)主講人：組胚教研室 林卡莉目的要求1、了解組織學(xué)制片的基本程序；2、熟悉HE染色的步驟；3、掌握HE染色結(jié)果的觀察。第二節(jié) 組織學(xué)常用的幾種標(biāo)本類型見視頻“組織學(xué)制片方法”1切片標(biāo)本：組織經(jīng)固定、切片（包括冰凍切片、石蠟切片及火棉膠切片）染色、封固而制成的各種玻片標(biāo)本。它為組織學(xué)中最常用的標(biāo)本。第二節(jié) 組織學(xué)常用的幾種標(biāo)本類型2鋪片標(biāo)本：將腸系膜或皮下組織鋪于載玻片上，經(jīng)固定、染色、封固而制成的標(biāo)本。4磨片標(biāo)本：不經(jīng)脫鈣及切片手續(xù)，而直接用手工在磨石上磨制成薄片，以便在顯微鏡下觀察的骨、牙磨片標(biāo)本。5分離標(biāo)本：將極小組織塊用化學(xué)藥物的水溶液浸泡后，溶去其

2、細(xì)胞間質(zhì)，采用機(jī)械分離方法（如振蕩、針撥等方式）使之分離成單個(gè)而又完整的細(xì)胞，經(jīng)染色后涂于載玻片上進(jìn)行鏡檢。7整裝標(biāo)本：一種是將很小的動(dòng)物或早期胚胎經(jīng)固定、染色后，封固于載玻片上。另一種是將小動(dòng)物、胚胎或病變器官經(jīng)固定后，保存于固定液中瓶裝供肉眼觀察用。可了解胚體的表面立體形態(tài)特征及病變部位與周圍組織的毗鄰關(guān)系。8活體標(biāo)本：如將蛙的口腔粘膜取下放于載玻片上，迅速滴加生理鹽水或Ringer氏液以觀察其纖毛運(yùn)動(dòng)。其它如精子運(yùn)動(dòng)亦可按此方法進(jìn)行觀察。9血管注射標(biāo)本： 一種是將樹脂類鑄形劑經(jīng)血管灌注后，用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿腐蝕血管周圍組織而制成的血管鑄形標(biāo)本，可瓶裝供肉眼觀察或進(jìn)一步處理后作掃描電鏡觀察。另一

3、種是將染料加明膠配制成染色液注入血管內(nèi)，然后取材、固定、包埋、切片和封固所制成的組織切片標(biāo)本。這類標(biāo)本主要用于了解血管的走行及其與所支配組織或器官的相互關(guān)系。 組織切片制作方法的基本程序：取材固定脫水透明包埋切片染色封固。(1) 所取材料越新鮮越好；(2) 切取組織的刀剪刃口必須鋒利 ；(3) 取材時(shí)必須考慮切面的方向 ；(4) 組織塊應(yīng)力求小而薄 ；(5) 收縮較大的新鮮組織 ；(6) 注意清潔 ；(7) 用作免疫組化的組織取材 ；(8) 病理取材 。2、組織取材時(shí)應(yīng)注意：粘膜粘膜下層肌層漿膜胃壁結(jié)構(gòu)模式圖使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，防止組織自溶；使組織成份轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗?/p>

4、性物質(zhì)從而有利于保存。這就是固定的基本意義。（三）標(biāo)本的固定1固定的目的(1)組織塊不宜太大，一般以厚度為2毫米，長(zhǎng)度不超過0.5厘米*0.5厘米。(2)固定液的量一般以組織塊大小的30倍為宜，最好在固定組織的瓶底墊上脫脂棉或幾層紗布以使固定液能從上下左右前后各方都能滲入組織塊。(3)固定的時(shí)間，一般以24小時(shí)為宜。2固定的注意事項(xiàng) (4)后固定：柔軟組織在新鮮時(shí)不易切成小塊，往往采用重新固定法處理。（5）特殊固定：神經(jīng)組織以在活體動(dòng)物灌流固定后再重新投入固定液為佳，有些組織如肺則采用由氣管注射固定液后再投入固定液為好。常用的固定液有：（1）10%福爾馬林液：商品甲醛（36%40%甲醛水溶液）

5、配成固定液其濃度為3.6%4%，也就是習(xí)慣上稱為10%的福爾馬林液。 （2）10%中性緩沖福爾馬林液：商品甲醛10ml，0. 1mol/L pH7.4 PBS 90ml。3固定劑用以固定組織的藥劑，稱為固定液。（1）灌注法（Irrigation method）自左心室插入主動(dòng)脈，先以生理鹽水沖冼血液后，注入固定液，30min后取材，置同一固定劑后固定。 （2）浸入法（Immersion method） 。4固定方法 材料固定后，藥劑繼續(xù)留在組織中，易使組織破壞，必須用水或酒精洗去。5固定后處理三種方式進(jìn)行處理：（3）直接入脫水劑。（2）酒精充分洗滌；（1）流水沖洗；4、常用的透明劑有二甲苯、甲

6、苯、氯仿等。 二甲苯：透明組織的能力強(qiáng)，但易使組織收縮和變脆，故在二甲苯中不宜擱置太久。 氯仿：其透明能力遠(yuǎn)比二甲苯慢，透明時(shí)間可以延長(zhǎng)至24小時(shí)也無(wú)妨。 3、透明的意義和作用： 透明劑能夠同時(shí)溶解于脫水劑及包埋劑當(dāng)中，它能逐漸滲入組織，最終將脫水劑完全排出。1 目的：由于生物體的組織有各種硬度不同的成份，必須加石蠟等作支持物質(zhì)滲入組織塊內(nèi)部，并將組織塊包埋起來，然后用切片機(jī)以制作極薄的切片。2 種類：包埋物質(zhì)目前廣泛采用的除石蠟外，還有火棉膠、炭蠟、明膠以及環(huán)氧樹脂、OTC(冰凍切片包埋劑）等。（五）包埋商品石蠟的處理：浸蠟 ：包埋：通常使用包埋盒。石蠟包埋法： 反復(fù)溶化、過濾以增加石蠟的硬

7、度和密度，并除去雜質(zhì)。溫度最好不超過該石蠟溶點(diǎn)的2以上；12h 。 包埋通常使用組織包埋機(jī)、包埋盒及配套使用的不銹鋼模具。把熔蠟倒入模具內(nèi)，再用加熱的彎曲鈍頭鑷子夾取已經(jīng)過浸蠟的組織塊，使切面朝下平正地置放于模具底面的中央處，然后放上包埋盒，繼續(xù)加滿蠟，待包埋盒表面的熔蠟?zāi)毯?，將其移入加冰塊的冷水中加速凝固，包埋即告完成。 170%乙醇 常溫 1224h 280%乙醇 常溫 1224h 390%乙醇 常溫 23h 495%乙醇 常溫 12h 595%乙醇 常溫 12h 6100%乙醇 常溫 1h 7100%乙醇 常溫 1h8二甲苯 常溫 1520min 9二甲苯 常溫 1520min 10石

8、蠟 4850 0.5h 11石蠟 4850 0.5h 12石蠟 5860 0.5h 13石蠟 5860 0.5h組織塊處理時(shí)間表 石蠟切片機(jī)可分三個(gè)部分，一是安裝切片刀的部分，有調(diào)節(jié)刀片斜度和固著刀片的螺旋。一是安裝材料的部分，也有螺旋可以調(diào)節(jié)材料的位置。另一是操縱在旋轉(zhuǎn)中向前推進(jìn)的部分，控制著切片的厚薄，是比較重要而復(fù)雜的部分。（六）組織切片技術(shù)1、切片機(jī)簡(jiǎn)介：石蠟切片機(jī)1、切片機(jī)德國(guó)冰凍切片機(jī)冰凍切片機(jī)制冷系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)樣/切片系統(tǒng) 照明系統(tǒng)2、載玻片和蓋玻片處理：新載玻片上有油污，必須經(jīng)過清潔液浸泡、充分漂洗、酒精浸泡、烤干備用。 (1) 明膠液：這是粘片最常用的膠液，簡(jiǎn)便優(yōu)良。 (2)蛋白

9、甘油：雞蛋清 50ml ，甘 油 50m1 ,水楊酸納 1g 。 （3）樹脂膠：又稱白色乳膠，使用濃度為1%2%，以蒸餾水稀釋即可。 （4） 多聚賴氨酸，APES（3-氨丙基-乙氧基甲硅烷）。3、載玻片上涂粘附劑：4切片步驟： （1）切片刀或一次性切片刀必須鋒利。（2）將切片刀安裝在持刀座上（以15為宜）。（3）將蠟塊（包埋盒）固定于支持器上，調(diào)整蠟塊和刀刃至適當(dāng)位置。（4）細(xì)心移動(dòng)刀座或蠟塊支持器，使蠟塊與刀刃接觸，旋緊刀座和蠟塊支持器。（5）修整蠟塊（粗切）：勻速旋轉(zhuǎn)切片輪，修切蠟塊表面至包埋其中的組織塊完整地全部切到。（6）調(diào)節(jié)切片厚度調(diào)節(jié)器（一般為46m），進(jìn)行切片，切出的蠟片應(yīng)連續(xù)成

10、蠟帶。蠟帶應(yīng)完整無(wú)缺，厚度適宜、均勻，無(wú)刀痕、顫痕、皺折、開裂、缺損、松解等。（7）以專用小鑷子輕輕夾到蠟片，放入伸展器的溫水中（42左右），使切片全面展開。（8）將蠟片附貼于包被有粘附劑的載玻片上，蠟片應(yīng)置放在載玻片右（或左）2/3處的中央，蠟片與載玻片之間無(wú)氣泡。（9）放入溫箱中，4045約1小時(shí)烘干即可。見視頻“使用切片機(jī)對(duì)石蠟包埋組織切片”（七）染色:1、染料及染色液簡(jiǎn)介： （1）蘇木精 （2）洋紅 （3）蘇丹 （4）伊紅 （5）堿性品（復(fù)）紅 （6）結(jié)晶紫 （7）亞甲藍(lán)或美藍(lán) （8）甲基綠 蘇 木 精 蘇木精是最常用的堿性染料之一。它是一種無(wú)色或淡灰黃色粉末，從分子結(jié)構(gòu)上，蘇木精沒有

11、發(fā)色團(tuán)，所以它本身不是染料，需要經(jīng)過氧化和媒染后，才成為一種很好的細(xì)胞核染料。 氧化有兩種方式： 1.自然氧化：需數(shù)周至數(shù)月。這種蘇木精染液的保存和使用壽命較長(zhǎng)。 2. 人工氧化：是指在配制蘇木精染液時(shí)加入一定量的氧化劑如氧化汞、碘酸鈉、高錳酸鉀或過氧化氫等可立即使蘇木精氧化成蘇木紅。 蘇木紅為弱酸性，呈紅色，對(duì)組織的親和力很小，但當(dāng)加入某些物質(zhì)如二價(jià)或三價(jià)的金屬鹽如鋁、鐵鹽后，染料分子就能與這些金屬鹽的離子結(jié)合形成色淀，這種色淀具有陽(yáng)電荷，能與特定的組織成份牢固結(jié)合。這些二價(jià)或三價(jià)的金屬鹽就稱為媒染劑。如硫酸鋁鉀、硫酸鋁銨、硫酸鐵銨。 染色機(jī)制還不很明確。從蘇木紅的結(jié)構(gòu)式看，原有助色團(tuán)羥基，

12、又有了發(fā)色團(tuán)醌型苯環(huán)，應(yīng)屬一種酸性染料，但由于酸性助色團(tuán)羥基的酸性很弱，對(duì)組織的親和力較小。加入媒染劑鋁鹽后，鋁鹽與蘇木紅螯合形成藍(lán)紫色的鋁-蘇木紅色淀，該色淀呈強(qiáng)鹽基性，帶正電荷，作用相當(dāng)于堿性染料，即帶正電荷的藍(lán)紫色色淀和帶負(fù)電荷的胞核脫氧核糖核酸磷酸基結(jié)合而完成染色。 性狀：紅色粉末，易溶于水，溶液呈綠色 熒光，能溶于醇。用途：組織學(xué)用于上皮細(xì)胞、肌纖維和細(xì) 胞質(zhì)、細(xì)胞間質(zhì)染色。伊 紅2、Ehrlich蘇木精的配制蘇木精 2克、銨明礬 3克、無(wú)水酒精100毫升、甘油 100毫升、蒸餾水100毫升。此液配成后，須經(jīng)12月，待它氧化成熟以后才能應(yīng)用，故必須先配制。3、伊紅液配制：伊紅 2克、

13、90%酒精 （或蒸餾水）200毫升。（1）取組織塊，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚46m。（2）切片常規(guī)二甲苯脫蠟，下行酒精至水。（3）明礬蘇木精液染色510min，自來水洗去浮色。（4）1%鹽酸乙醇分化20s（提插數(shù)下）。（5）自來水浸泡1 h。4、HE染色（6）上行酒精脫水：70乙醇5min80乙醇5min90乙醇5min。（7）置1%伊紅液25min。（8）常規(guī)脫水，透明，封片。胞核，嗜堿性，染為紫藍(lán)色胞質(zhì)，嗜酸性，染為紅色 5、關(guān)于HE染色時(shí)注意事項(xiàng)：（1）用含升汞的固定液固定的組織塊,在切片染色前，應(yīng)進(jìn)行脫汞。具體方法：切片脫蠟，逐次進(jìn)入70%酒精后，入稀碘液（碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水3000ml）510min。蒸餾水稍洗，入5%硫代硫酸鈉溶液內(nèi)5min。蒸餾水充分洗后進(jìn)入染色。（2）切片必須要充分干燥后才能進(jìn)行染色；而染色過程中切忌讓切片干燥。（3）用伊紅水溶液染切片時(shí)，往往在經(jīng)脫水的低濃度酒精時(shí)極易脫色，特別是對(duì)于細(xì)胞密集的組織更易出現(xiàn)這種情況。而用95%酒精配制的1%伊紅染液則可獲較滿意效果。（4）切片染蘇木精后，分色這一步驟極為重要，應(yīng)