植物基因工程載體及其構(gòu)建課件

1、第三章植物基因工程載體及其構(gòu)建第三章植物基因工程載體及其構(gòu)建第一節(jié) 載體概述1.載體概念載體(vector)：能夠承載外源基因，并將其轉(zhuǎn)入受體細胞進行擴增和表達的DNA分子。運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞；為外源基因提供復(fù)制能力和整合能力；為外源基因的擴增或表達提供必要的條件；功能所以，目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細胞，并在其中維持高效表達，很大程度上取決于載體。第一節(jié) 載體概述1.載體概念載體(vector)：能夠承載外具備復(fù)制原點，在宿主細胞內(nèi)能夠自主復(fù)制；具備適宜的酶切位點，供外源片段插入；含有供選擇轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因；適當(dāng)?shù)目截悢?shù)：較高的拷貝數(shù)，便于回收、制備；載體的平安性：對受體細胞無毒害，

2、不能隨便轉(zhuǎn)移；載體大小：原那么上要求載體越小越好；如果需要外源基因的表達：啟動子。載體應(yīng)具備的條件具備復(fù)制原點，在宿主細胞內(nèi)能夠自主復(fù)制；載體應(yīng)具備的條件植物基因工程載體及其構(gòu)建課件2.載體的種類按來源分：細菌質(zhì)粒載體病毒載體噬菌體載體轉(zhuǎn)座子載體Ti 質(zhì)粒Ri 質(zhì)粒人工染色體載體、線粒體載體、葉綠體載體等2.載體的種類按來源分：細菌質(zhì)粒載體病毒載體噬菌體載體轉(zhuǎn)座子按功能分：克隆載體：主要用來克隆和擴增DNA片段，能帶動外源基因在宿主細胞中復(fù)制擴增。表達載體：除具有克隆載體的根本元件外，還具有轉(zhuǎn)錄、翻譯所必需的DNA元件，使外源基因在宿主細胞中有效表達。整合載體：將目的基因插入到受體染色體中。按

3、功能分：克隆載體：主要用來克隆和擴增DNA片段，能帶動外源目的基因克隆載體中間載體卸甲載體轉(zhuǎn)化載體其功能是保存和克隆目的基因。與微生物基因工程相似，通常是由多拷貝的E. Coli小質(zhì)粒為載體。切除致瘤基因的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒，是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的受體質(zhì)粒。中間克隆載體中間表達載體大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DNA片段及目的基因、標(biāo)記基因等。是構(gòu)建中間表達載體的根底質(zhì)粒。含有植物特異啟動子的中間載體。作為構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒。最后用于目的基因?qū)胫参锛毎妮d體，工程載體。由中間表達載體和卸甲載體構(gòu)建。目的基因克隆載體中間載體卸甲載體轉(zhuǎn)化載體其功能是保存和克隆目第二節(jié) 質(zhì)粒載體質(zhì)粒(plasmid)：存在于細菌

4、或真菌染色體外的小型環(huán)狀(線型質(zhì)粒DNA分子線蟲、衣藻等)雙鏈DNA分子(酵母的“殺傷質(zhì)粒是RNA)，可自身復(fù)制和表達。不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力帶有抗性基因等。分子量在1-200 kb之間。1、質(zhì)粒plasmid概念第二節(jié) 質(zhì)粒載體質(zhì)粒(plasmid)：存在于細菌或真菌染色質(zhì)?？臻g構(gòu)型超螺旋：共價閉合環(huán)狀DNA開環(huán)DNA：1條鏈上有一至數(shù)個缺口線型DNA：最快的是超螺旋，其次是線性DNA，最慢的是開環(huán)DNA。2、質(zhì)粒plasmid構(gòu)象質(zhì)?？臻g構(gòu)型超螺旋：共價閉合環(huán)狀DNA開環(huán)DNA：1條鏈上有3、質(zhì)粒的自主復(fù)制性嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent p

5、lasmid）拷貝數(shù)少，只有13份拷貝。 松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid）拷貝數(shù)多，有幾十幾百份拷貝。 質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進行自主復(fù)制質(zhì)粒。DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)拷貝數(shù)多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：3、質(zhì)粒的自主復(fù)制性嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent pla植物基因工程載體及其構(gòu)建課件4、質(zhì)粒的不相容性同種的或親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒，含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不能同時穩(wěn)定地保持在一個細胞內(nèi)的現(xiàn)象，稱為質(zhì)粒不相容性。不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。在第二個質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時，不相容的質(zhì)粒一般為利用同一復(fù)制系統(tǒng)，質(zhì)

6、粒分配到子細胞時會發(fā)生競爭，隨機挑選，最終放大。4、質(zhì)粒的不相容性同種的或親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒，含有相似復(fù)5、質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性接合型質(zhì)粒：能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞接合作用。甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到受體菌種。非接合型質(zhì)粒：不能再天然條件下獨立地發(fā)生接合作用。某些非接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移。由mob、tra基因順式因子bom及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點nic決定。5、質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性接合型質(zhì)粒：能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞植物基因工程載體及其構(gòu)建課件6、攜帶特殊的遺傳標(biāo)記物質(zhì)抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質(zhì)合成：抗生素、

7、細菌毒素、有機堿對重組DNA分子的篩選十分重要！選擇標(biāo)記：用于轉(zhuǎn)化子的挑選；篩選標(biāo)記：用于重組子的挑選；轉(zhuǎn)化子：成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主細胞；重組子：真正含有重組DNA的轉(zhuǎn)化子。按用途可分為選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因。6、攜帶特殊的遺傳標(biāo)記物質(zhì)抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離植物基因工程載體及其構(gòu)建課件植物基因工程載體及其構(gòu)建課件篩選標(biāo)記基因插入失活法篩選標(biāo)記基因插入失活法互補篩選法lacZ編碼-半乳糖苷酶，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其表達 (乳糖既是誘導(dǎo)物, 也是底物)；IPTG：乳糖衍生物，可作為lac操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反響底物；X-gal：可作 lac操縱子的底物，不能作為誘導(dǎo)物。還可作

8、為生色劑，被-半乳糖苷酶分解后產(chǎn)生蘭色物質(zhì)，使菌落呈現(xiàn)蘭色?；パa篩選法lacZ編碼-半乳糖苷酶，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其lac Z M15 放在F質(zhì)粒上，隨宿主傳代；lac Z 放在載體上，作為篩選標(biāo)記；受體菌有JM系列、TG1和XL1-Blue等。lac Z M15 ：缺失-半乳糖苷酶第11-41個aa；lac Z ：只編碼N端140個aa；lac Z M15 + lac Z =功能互補在lac Z 編碼區(qū)上游插入一小片段DNA (如51bp的MCS)，不影響-半乳糖苷酶的功能互補。但在該小片段DNA中再插入一個片段，將導(dǎo)致產(chǎn)生無互補能力的-半乳糖苷酶片段；lac Z M15 放在F質(zhì)粒上，隨

9、宿主傳代；lac Z 植物基因工程載體及其構(gòu)建課件7、天然質(zhì)粒載體的局限性1分子量大，拷貝數(shù)低第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長 9.1 kb。但只有一個EcoR I切點充當(dāng)克隆位點，Tetr 作為篩選標(biāo)志。2篩選標(biāo)志不理想，適宜的單一酶切位點少ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1colicin E1。殺死不含ColE1 質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑。唯一的克隆位點 EcoR I 正好位于這個基因的內(nèi)部。7、天然質(zhì)粒載體的局限性1分子量大，拷貝數(shù)低第一個用于基改造策略：去掉多余片段：縮小質(zhì)粒分子量，提高外源DNA片段的裝載量；減少限制性酶切位點：缺失突變，限制性酶、核酸外切酶和連接

10、酶.；提供多克隆位點易識別的選擇標(biāo)記：通過質(zhì)粒之間的重組導(dǎo)入；平安性改造：質(zhì)粒載體不能在細菌間隨便轉(zhuǎn)移；增加輔助功能：表達載體。改造策略：8、常用的質(zhì)粒載體1pBR322質(zhì)粒載體F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。復(fù)制起點：pMB1系列來源于ColE1的高拷貝型復(fù)制起點， 高達1000-3000個拷貝；Ampr基因：pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因；Tetr基因：pSC101的Tetr 基因；長度：4361 bp；選擇標(biāo)記：氨芐青霉素和四環(huán)素抗性；多克隆位點：24個克隆位點；其中9個會導(dǎo)致Tetr基因失活如BamH I、Hind 、Sal I； 3個會導(dǎo)致Ampr基

11、因失活Sca I、PvuI、Pst I。8、常用的質(zhì)粒載體1pBR322質(zhì)粒載體F. Boliv衍生質(zhì)粒：pBR325、pBR327及pAT153等。衍生質(zhì)粒：pBR325、pBR327及pAT153等。2pUC質(zhì)粒載體University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的根底上改造而成。屬正選擇載體。復(fù)制起點：pBR322的 oriAmpr基因：pBR322Ampr基因，不含原有酶切位點；lacZ啟動子：大腸桿菌；lacZ基因：大腸桿菌lacZ的氨基酸片段；長度：約2.7 kb；克隆位點：10個連續(xù)的單一酶切位點，位于lacZ

12、基因5端。選擇標(biāo)記：氨芐青霉素和藍白斑篩選；2pUC質(zhì)粒載體University of CalifopUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19更小的分子量；選擇方便：正向選擇，可顯色和抗菌素雙重直接選擇；克隆便利：具有多克隆位點，外源DNA方便插入；測序方便：pUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到M13載體上測序。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC3pGEM系列載體由pUC派生而來。與pUC的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個噬菌體啟動子T7和SP6?？蓪Σ迦肫芜M行轉(zhuǎn)錄。還參加了絲狀噬菌體f1的復(fù)

13、制起點。3pGEM系列載體由pUC派生而來。與pUC的主要區(qū)別是3pBluescript II KS()系列載體在MCS的兩側(cè)分別加了一個噬菌體啟動子T7和T3?？蓪Σ迦肫芜M行轉(zhuǎn)錄。還參加了絲狀噬菌體f1的復(fù)制起點。3pBluescript II KS()系列載體在MC9、PCR產(chǎn)物克隆載體1T載體PCR產(chǎn)物往往在3端突出一個或多個A，將T-載體的MCS中部已經(jīng)切開，各有一個3端突出的T。所以能與這個載體直接連接，這種克隆稱為T-A克隆。目前，目的基因的獲得幾乎都是用PCR的方法，如何將PCR產(chǎn)物連接到載體上？克隆載體線性化；克隆載體末端補平；克隆載體末端加T。9、PCR產(chǎn)物克隆載體1T載體

14、PCR產(chǎn)物往往在3端突出商業(yè)化T載體一般來說，商業(yè)化的T載體多是先使用平端限制性內(nèi)切酶如EcoRV將克隆載體進行線性化，然后再單獨參加dTTP和Taq酶7275反響，進行末端的加T。自制T載體一種常見的自制方法是利用限制性內(nèi)切酶制造出具有單個T末端突出的片段，最常用的內(nèi)切酶為XcmI，其識別和切割特點如下：商業(yè)化T載體植物基因工程載體及其構(gòu)建課件植物基因工程載體及其構(gòu)建課件6、攜帶特殊的遺傳標(biāo)記T-DNA區(qū) (transferred DNA regions)VirD2及VirE2上有核定位信號，但VirE2與VirD2相比，其核定位功能較弱。賦予寄主菌株對土壤桿菌素的反響性；具備復(fù)制原點，在宿

15、主細胞內(nèi)能夠自主復(fù)制；該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒區(qū)。質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進行自主復(fù)制質(zhì)粒。2-3h，OD600=0.含有植物特異啟動子的中間載體。Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域RecombinantsLOC_Os10g41770拷貝數(shù)多，有幾十幾百份拷貝。lacZ啟動子：大腸桿菌；1T-DNA的加工及轉(zhuǎn)移人工染色體載體、線粒體載體、葉綠體載體等VirD:包含VirD1、VirD2、VirD3、VirD4。TOPO技術(shù)拓撲異構(gòu)酶I在位點CCCTT切斷并松弛超螺旋DNA，然后重新連接末端。這樣，其同時作為限制酶和連接酶。TOPO克隆是一種將拓撲異構(gòu)酶與 T

16、- 載體相結(jié)合的 PCR 產(chǎn)物快速克隆系統(tǒng) pCR-TOPO ，無需 DNA 連接酶做連接。3末端的突出 T 上共價結(jié)合了一個拓撲異構(gòu)酶 ，當(dāng)帶 3 末端的突出 A 的 PCR 產(chǎn)物與該 T 載體互補配對時，拓撲異構(gòu)酶 就將該缺口連接起來。6、攜帶特殊的遺傳標(biāo)記TOPO技術(shù)拓撲異構(gòu)酶I在位點CCCT因為越來越多高確限度熱穩(wěn)定酶如Pfx、Pfu被用于PCR擴增，使到PCR后都只是平端產(chǎn)物。這種平端克隆往往效率低，并且有非特異性背景菌落產(chǎn)生，造成篩選困難。2平末端PCR產(chǎn)物載體因為越來越多高確限度熱穩(wěn)定酶如Pfx、Pfu被用于PCR擴增TOPO-Blunt載體在 lacZ基因的下游融合了一個 cc

17、dB Control of cell death基因，該基因?qū)Υ竽c桿菌是致死的。載體切成線狀，再與目標(biāo) DNA 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。外源 DNA 片段與載體連接后，ccdB 基因的表達受到阻斷，重組質(zhì)粒才能在大腸桿菌中存在下來。如果沒有DNA片斷插入，ccdB基因那么會表達，造成細菌染色體的降解導(dǎo)致細菌死亡。TOPO-Blunt載體在 lacZ基因的下游融合了一個 TOPO克隆高效性原理Topo連接反響有兩個分子參與，而傳統(tǒng)的連接反響有三個分子參與，其熱力學(xué)上的優(yōu)勢導(dǎo)致5分鐘的快速連接。TOPO克隆高效性原理10、質(zhì)粒提取細菌培養(yǎng)和富集細胞懸浮細胞破碎細胞碎片基因組去除蛋白去除質(zhì)粒收集溶液1：

18、50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl，10 mM EDTA，pH 8.0溶液2：0.2 N NaOH ，1% SDS；溶液3：3 M 醋酸鉀 ，2 M 醋酸苯酚、氯仿抽提異丙醇/乙醇沉淀，70%乙醇清洗10、質(zhì)粒提取細菌培養(yǎng)和富集細胞懸浮細胞破碎細胞碎片基因組去具備復(fù)制原點，在宿主細胞內(nèi)能夠自主復(fù)制；具備適宜的酶切位點，供外源片段插入；含有供選擇轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因；適當(dāng)?shù)目截悢?shù)：較高的拷貝數(shù)，便于回收、制備；載體的平安性：對受體細胞無毒害，不能隨便轉(zhuǎn)移；載體大?。涸敲瓷弦筝d體越小越好；如果需要外源基因的表達：啟動子。載體應(yīng)具備的條件具備復(fù)制原點，在宿主細胞內(nèi)能夠自主復(fù)制；載體應(yīng)具備的

19、條件11、大腸桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化1熱激法挑選單菌落過夜振蕩培養(yǎng)取1ml菌液+50ml培養(yǎng)基2-3h，OD600=0.6取1ml菌液+50ml培養(yǎng)基2-3h，OD600=0.6低溫低速離心收集細胞0.1MCaCl2懸浮處理細胞2ml0.1MCaCl2懸浮細胞，分裝，-80保存。感受態(tài)細胞制備轉(zhuǎn)化取出感受態(tài)冰浴解凍參加連接產(chǎn)物/質(zhì)粒冰浴30 min42熱激90 S冰浴1 min參加1 ml LB培養(yǎng)基培養(yǎng)45 min復(fù)蘇產(chǎn)物體系不超過1/10收集菌體，涂板篩選，過夜培養(yǎng)11、大腸桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化1熱激法挑選單菌落過夜振蕩2電擊法當(dāng)細菌長到對數(shù)中期；冷卻，離心；然后用冷卻的去離子水反復(fù)清洗；最

20、后用10%甘油重懸；超低溫保存。感受態(tài)細胞制備轉(zhuǎn)化受電場強度、電脈沖長度和DNA濃度等參數(shù)的影響。電壓和電脈沖長度增高，轉(zhuǎn)化的細胞數(shù)量也有所提高，但存活率下降。電壓：2.5 kv，電阻：300歐； 電容：2.5 uF2電擊法當(dāng)細菌長到對數(shù)中期；感受態(tài)細胞制備轉(zhuǎn)化受電場強度12、大腸桿菌重組子篩選和檢測12、大腸桿菌重組子篩選和檢測思考題 BamH Xba EcoR IBamH IXba IPCR檢測正確，片段已經(jīng)整合進載體；用BamH和Xba切不出目的片段；載體酶切位點在大腸桿菌中被甲基化；載體構(gòu)建過程中出現(xiàn)星活性；思考題 BamH Xba EcoR IB第三節(jié) 工程載體植物基因轉(zhuǎn)化載體必須具

21、備的功能能作為媒介將外源基因?qū)氲街参锛毎?，并整合到宿主細胞的基因組DNA上；能提供被寄主細胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識別的DNA序列，即啟動子和復(fù)制子，以保證轉(zhuǎn)化的外源基因能在植物細胞中進行復(fù)制和表達。第三節(jié) 工程載體植物基因轉(zhuǎn)化載體必須具備的功能能作為媒介將外一、根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體1、Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子， 約有200kb組成。章魚堿型 (octopine)；胭脂堿型 (nopaline)；農(nóng)桿堿型 (agropine)；農(nóng)桿菌素堿型(agrocinoine)或稱琥珀堿型。根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中合成的冠癭堿種類的不同

22、，Ti質(zhì)?？煞殖伤姆N類型：一、根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體1、Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型Ti質(zhì)Agrobacterium tumefaciens章魚堿型 (octopine)Agrobacterium tumefaciens章魚堿型 2. Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域T-DNA區(qū)transferred-DNA regions： T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的onc基因與腫瘤的形成有關(guān)。Vir區(qū)virulence region 該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA

23、上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。Con區(qū)regions encoding conjugations 該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因tra，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。Ori區(qū)origin of replication 該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。 2. Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域T-DNA區(qū)transferre植物基因工程載體及其構(gòu)建課件T-DNA區(qū) (transferred DNA regions)T-DNA：農(nóng)桿菌侵染植物時，從Ti質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細胞的一段DNA。23kb左右，攜帶

24、有致瘤基因和冠癭堿合成酶基因；T-DNA區(qū)的致瘤基因是一些與激素合成有關(guān)的基因。這些基因的表達，破壞了植物體內(nèi)正常的激素平衡，導(dǎo)致植物冠癭廇的出現(xiàn)；T-DNA兩端各有一高度同源的25bp的重復(fù)序列，分別稱為左邊界序列(LB)和右邊界序列(RB)， 對T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞至關(guān)重要 (尤其是RB)。T-DNA區(qū) (transferred DNA regionVir區(qū)的基因與T-DNA從細菌轉(zhuǎn)移到植物細胞的遺傳過程有關(guān)，能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性；Vir區(qū)總長約35kb，包括7個基因，VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH；VirA：組成性表達；VirB、VirC、Vi

25、rD、VirE：誘導(dǎo)性表達： VirG：受信號分子誘導(dǎo)后表達量提高10多倍；信號分子：乙酰丁香酮等。Vir區(qū) (毒性區(qū))植物細胞創(chuàng)傷信號AS結(jié)合并激活VirA，VirA轉(zhuǎn)移磷酸基團激活VirG，形成二聚物，結(jié)合到Vir基因啟動子區(qū)域，激活這些基因的表達。雙因子調(diào)控體系。Vir區(qū)的基因與T-DNA從細菌轉(zhuǎn)移到植物細胞的遺傳過程有關(guān)毒性區(qū)對T-DNA的作用既可以順式作用進行，也可以反式作用進行。兩種情況下T-DNA都可在毒性區(qū)作用下轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中；順式作用：指T-DNA區(qū)與毒性區(qū)位于同一個Ti質(zhì)粒上；反式作用：指T-DNA與毒性區(qū)不在同一Ti質(zhì)粒上，而位于另一個相應(yīng)的中間載體質(zhì)粒上。毒性

26、區(qū)對T-DNA的作用既可以順式作用進行，也可以反式作用進調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制。Con區(qū) (接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)) 具有在細菌間進行接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因(tra)，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。Ori區(qū) (origin of replication)細菌吸收和利用冠癭堿的區(qū)域，具有冠癭堿分解酶基因如章魚堿分解酶基因Occ。冠癭堿代謝區(qū) (opine catabolism)調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制。Con區(qū) (接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)) 具有在植物基因工程載體及其構(gòu)建課件4、Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機理農(nóng)桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。1T-DNA的加工及轉(zhuǎn)移下鏈25bp重復(fù)序列的右邊界左起第3和第4堿基間缺口剪

27、切，然后從缺口5端開始合成新的DNA鏈，并一直延伸到左邊界第22堿基處，置換出原來的下鏈，形成ssDNA，即T鏈。4、Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機理農(nóng)桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間VirD:包含VirD1、VirD2、VirD3、VirD4。 VirD1具有拓撲異構(gòu)酶活性，將超螺旋DNA變?yōu)樗沙贒NA； VirD2具有核酸內(nèi)切酶活性，切割雙鏈DNA的一條鏈。C端有核定位信號。VirC:包含VirC1和VirC2。 為ATPase，對質(zhì)粒DNA的準(zhǔn)確剪切是必需的。VirD:包含VirD1、VirD2、VirD3、VirD42T鏈復(fù)合物的形成T鏈必須橫向跨越細菌細胞膜、細菌細胞壁、植物細胞壁、植物細胞膜

28、及核膜，才能整合進植物基因內(nèi)。鏈必須防止被核酸降解，因此鏈可能以一種DNA-蛋白復(fù)合體形式存在。VirD2從T-DNA的產(chǎn)生到整合到植物基因組整個過程，都與T-DNA共價結(jié)合在一起。VirE2編碼ssDNA結(jié)合蛋白,與任何ssDNA結(jié)合。通達與鏈非共價結(jié)合，VirE2可包被T鏈,形成細長的核-蛋白絲,因而故VirE2不僅保護ssDNA,使ssDNA抗3和5外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶，而且T使鏈形變成一種可轉(zhuǎn)運的形式。2T鏈復(fù)合物的形成T鏈必須橫向跨越細菌細胞膜、細菌細胞壁3T鏈復(fù)合物的轉(zhuǎn)運形成跨膜孔道，需要跨膜或者膜結(jié)合蛋白的參與；VirB蛋白在膜上形成一種類似于細菌結(jié)合轉(zhuǎn)移時從工體菌轉(zhuǎn)至受體菌所

29、必需的結(jié)構(gòu)，即接合孔或性毛，T-DNA通過這種孔由細菌進入到植物細胞。同時VirB也可能起運輸和提供能量的作用。3T鏈復(fù)合物的轉(zhuǎn)運形成跨膜孔道，需要跨膜或者膜結(jié)合蛋白的4T鏈復(fù)合體靶向植物細胞核 VirD2及VirE2上有核定位信號，但VirE2與VirD2相比，其核定位功能較弱。VirD2可能以一種極性方向，首先將T復(fù)合體定向至核孔，而virE2那么作為一種促進因子，保證很長的T復(fù)合體在進入核孔時不受干擾。VirD2及VirE2蛋白上的核定位信號與動物相似，說明植物和動物的這種信號從進化上講是保守的。 4T鏈復(fù)合體靶向植物細胞核 VirD2及VirE2上有核5T鏈整合到基因組T-DNA在植物

30、染色體中的插入是隨機的。它可插入任何一條植物染色體。但插入位點常有以下特點：T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活潑的植物基因位點；T-DNA與植物DNA連接處富含A，T堿基對；植物DNA上的插入靶位點與T-DNA邊界序列有一定程度的同源性。由于這種同源性才使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地發(fā)生DNA鏈的交換。T-DNA的整合是異常重組的結(jié)果。T-DNA右未端在靶序列的識別及連接中是必需的，T-DNA左未端和兩個靶DNA未端那么參與局部配對和DNA修復(fù)。5T鏈整合到基因組T-DNA在植物染色體中的插入是隨機的T-DNA插入的遺傳特性：T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多數(shù)插入會導(dǎo)致

31、靶位點處小的缺失，缺失多至79個核苷酸。另一個常見的結(jié)果是，在T-DNA植物DNA連接處，會有幾個至33個核苷酸的“填充DNAFiller DNA存在，這些“填充DNA的序列與靠近連接處的植物DNA序列相似。在植物靶位處不要求有特異的序列，但假設(shè)在T-DNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列510b同源，那么可以在整合中起作用。T-DNA插入的遺傳特性：植物基因工程載體及其構(gòu)建課件4、Ti質(zhì)粒的生物學(xué)功能為農(nóng)桿菌提供附著于植物細胞壁的能力；為寄主細胞合成植物激素IAA和細胞分裂素；誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)學(xué)特征和冠癭堿成分；賦予寄主菌株分解代謝各種冠癭堿的能力；賦予寄主菌株對土

32、壤桿菌素的反響性；決定寄主菌株的植物寄主范圍；抑制某些根瘤農(nóng)桿菌噬菌體的生長和發(fā)育。4、Ti質(zhì)粒的生物學(xué)功能為農(nóng)桿菌提供附著于植物細胞壁的能力；4、Ti質(zhì)粒的改造Ti質(zhì)粒分子量過大，200kb左右，難以操作；分布著各種限制酶的多個切點，難以找到可利用的單一限制性內(nèi)切酶位點；T-DNA區(qū)Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，誘發(fā)腫瘤，阻礙細胞的分化和植株的再生；Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制, 即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進行擴增；而農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率極低10左右拷貝數(shù)少；Ti質(zhì)粒上還存在一些對于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的序列。 野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：4

33、、Ti質(zhì)粒的改造Ti質(zhì)粒分子量過大，200kb左右，難以操一元載體和雙元載體一元載體和雙元載體植物基因工程載體及其構(gòu)建課件植物基因工程載體及其構(gòu)建課件酶切連接系統(tǒng)酶切連接系統(tǒng)同源重組系統(tǒng)Gateway克隆技術(shù)是利用噬菌體與大腸桿菌的染色體之間發(fā)生的嗜菌體位點特異重組系統(tǒng)的重組整合與切出反響。創(chuàng)立Gateway克隆，通過PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進入門載體?；旌习康幕虻娜腴T克隆和適宜的目的載體及Gateway LR Clonase酶，產(chǎn)生表達克隆。表達克隆用來在適宜的宿主中進行蛋白的表達和分析。 Gateway技術(shù)也利用了ccdB選擇方法，以確保高效率的別離重組克隆。典型的效率是

34、95。同源重組系統(tǒng)Gateway克隆技術(shù)是利用噬菌體與大腸桿菌的infusion重組系統(tǒng)infusion重組系統(tǒng)5、表達載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)制備CaCl2法：與大腸桿菌根本一致區(qū)別：菌液需參加抗生素篩選； 培養(yǎng)時間更長； 培養(yǎng)溫度28； 超低溫保存用甘油。轉(zhuǎn)化5、表達載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)制備CaCl2法：與大腸桿菌轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后如何進行酶切鑒定？轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后如何進行酶切鑒定？二、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒載體發(fā)根農(nóng)桿菌與根癌農(nóng)桿菌都能侵染植物細胞，但病癥不同。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細胞產(chǎn)生許多不定根。能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物及裸子植物。發(fā)根農(nóng)桿菌同樣具有與Ti質(zhì)粒相似的稱之為Ri的

35、巨大質(zhì)粒。Ri質(zhì)?？梢圆挥谩敖獬溲b進行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的發(fā)根能夠再生；發(fā)狀根是單細胞克隆，防止產(chǎn)生嵌合體；可直接作為中間載體；發(fā)根適于離體培養(yǎng)，離體培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物合成能力更強。根據(jù)轉(zhuǎn)化植物后產(chǎn)生的毛狀根合成冠癭堿的類型不同，分為：甘露堿型、黃瓜堿型和農(nóng)桿堿型。二、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒載體發(fā)根農(nóng)桿菌與根癌農(nóng)桿菌都能侵染植物從開展植物基因工程載體考慮，Ri質(zhì)粒是頗有吸引力的。這是因為在不同的雙子葉植物中，由Ri質(zhì)粒誘發(fā)產(chǎn)生的合成冠癭堿不定根組織，經(jīng)過培養(yǎng)基中的植物激素的刺激作用，都可再生成可育的完整的植株。解釋Ti質(zhì)粒載體的許多概念對于Ri質(zhì)粒載體也是適用的?，F(xiàn)在已開展出了Ri質(zhì)粒載體的共合體系從開展

36、植物基因工程載體考慮，Ri質(zhì)粒是頗有吸引力的。這是因為三、植物病毒載體植物病毒及其它的一些病原體，是一類能夠在感染的植物寄主細胞中進行復(fù)制和表達的“外來的核酸類型。以植物病毒作為植物基因工程的克隆載體具有的優(yōu)點。有一局部植物病毒對寄主的感染是系統(tǒng)性的，它能夠?qū)⑵浠蚪M擴散到被感染植株的所有細胞。植物病毒載體，如雙子座病毒組病毒由于具有廣泛的寄主范圍，存在著被開展作為單子葉植物基因克隆載體的潛力。被感染的植株能夠繁殖出大量的病毒顆粒。類型：單鏈的RNA植物病毒、單鏈的DNA植物病毒和雙鏈的DNA植物病毒。三、植物病毒載體植物病毒及其它的一些病原體，是一類能夠在感染1、單鏈的RNA植物病毒90以上

37、的植物病毒的遺傳物質(zhì)，都是具有感染性的正鏈RNA。反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶，將單鏈的病毒 RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈的 DNA；然后把這種 DNA克隆到一種原核生物的質(zhì)粒或柯斯質(zhì)粒載體上；在形成的重組質(zhì)粒分子中，外源基因是插入在dcDNA局部；將帶有外源基因的病毒載體重新導(dǎo)入植物寄主細胞。1、單鏈的RNA植物病毒90以上的植物病毒的遺傳物質(zhì)，都是植物基因工程載體及其構(gòu)建課件2、單鏈植物DNA病毒載體2、單鏈植物DNA病毒載體植物基因工程載體及其構(gòu)建課件3、雙鏈DNA植物病毒載體花椰菜花葉病毒組和黃瓜脈病毒組將目的基因插入到CaMV DNA上特定的非功能區(qū)域，不影響病毒基因組的侵染性。CaMV侵染植物以后復(fù)

38、制在寄主核內(nèi)；目的基因不能整合到染色體上，但是可以穩(wěn)定表達；基因組35S啟動子可在植物細胞內(nèi)高效表達，可用于基因過表達。局限性：容納外源基因能力有限，寄主范圍也有限；感染后寄主植物易患病，產(chǎn)量品質(zhì)下降；不能感染整個植株，需通過原生質(zhì)體克服。3、雙鏈DNA植物病毒載體花椰菜花葉病毒組和黃瓜脈病毒組將目第四節(jié) 標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因 (selectable marker gene)：編碼產(chǎn)物能使轉(zhuǎn)化的細胞、組織具有對抗生素、除草劑的抗性或代謝的優(yōu)越性，從而將轉(zhuǎn)化的細胞、組織篩選出來的一類基因；報告基因 (reporter gene)：編碼產(chǎn)物能夠被快速測定，用來判斷外源基因是否已成功導(dǎo)入受體細胞、組

39、織，并檢測其表達活性的一類基因；報告基因?qū)嵸|(zhì)上起到了標(biāo)記基因的作用，故當(dāng)其被用來區(qū)分轉(zhuǎn)化細胞時, 也可將其稱為標(biāo)記基因。第四節(jié) 標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因 (selectable mar1 標(biāo)記基因和報告基因的構(gòu)建標(biāo)記基因：與適當(dāng)?shù)慕M成型啟動子構(gòu)成嵌合基因，克隆在質(zhì)粒載體上，導(dǎo)入受體細胞內(nèi)；報告基因：將其編碼區(qū)與位于其上游或下游的目的基因融合，置于目的基因啟動子的控制之下, 克隆到質(zhì)粒載體上，導(dǎo)入細胞內(nèi)。1 標(biāo)記基因和報告基因的構(gòu)建標(biāo)記基因：與適當(dāng)?shù)慕M成型啟動子2 轉(zhuǎn)基因植物常用的標(biāo)記基因編碼正常植物細胞中不存在的產(chǎn)物；基因較小，易構(gòu)成嵌合基因；能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達；容易檢測，并能定量分析。選擇標(biāo)記基因應(yīng)具備的特征2 轉(zhuǎn)基因植物常用的標(biāo)記基因編碼正常植物細胞中不存在的產(chǎn)物常用的選擇標(biāo)記基因抗生素抗性基因：npt (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶), hpt (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶), cat (氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)等；除草劑抗性基因：pat (抗磷化麥黃酮), sul (抗磺胺類除草劑), epsps (抗草甘膦)；糖代謝途徑相關(guān)基因：pmi (6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶)激素代謝途徑相關(guān)基因：ipt (異戊烯基轉(zhuǎn)移酶), iaah (吲哚乙酰胺水解酶), dhfr (二氫葉酸復(fù)原酶)。常用的選擇標(biāo)記基因抗生素抗性基因：npt (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶3