酵母雙雜交文庫篩選與蛋白互作驗證服務(wù)

1、酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的一種蛋白組學(xué)方法，是基于對真核生物的 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識而發(fā)明的技術(shù)。其基本原理是利用真核生物酵母的轉(zhuǎn)錄激 活因子Gal4可分為結(jié)構(gòu)上分開并且功能獨立的兩個結(jié)構(gòu)域：N端1-147aaDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,BD)和 C 端 768-881aa 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation Domain,AD)，Gal4 的N端和C端可以分開構(gòu)建表達質(zhì)粒，將N端和誘餌蛋白(研究的目標蛋白A)融合表達，C端和細胞cDNA或者獵物蛋白X融合表達，如果cDNA編碼的蛋白x能和A互相作用，就 能把Gal4的C端和N端聯(lián)系在一起，

2、形成轉(zhuǎn)錄因子，激活UAS下游的基因表達，原理如圖 1所示。圖 1 酵母雙雜交技術(shù)原理圖(引自 MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3&Libraries User Manual).公司選用的是美國Clontech公司(現(xiàn)為Takara公司收購)的MatchMaker系列酵母 雙雜交系統(tǒng)，所用的AH109, Y187酵母菌株，是通過基因工程的方法突變了內(nèi)源Gal4轉(zhuǎn)錄 因子的工程菌株，并在GAL4 UASs和啟動子的下游構(gòu)建了 3個報道基因-ADE2，HIS3，MEL1(或LacZ)，因此可以通過營養(yǎng)缺陷和顯色報告基因的表達來篩選或驗證兩個蛋白之間是否存在相互作用

3、。菌株信息如圖2所示。TABLE 1. MATCHMAKER VEAST STRAIN GENOTYPESStMtnGenoiype3F?eference$AHW9b0 -皿心$ 10 ura3-&2 $3-200, gai4AtLYS2: GALJ-GAL 1T.v-HfS3tGALg-GAL2taADEZURA3 ： MEL -MEL 板腿已 MEL 1Our unpublished observations107ura3-52r his3-200r de2-1Q1, trpl-901,URA3:區(qū) IgGHL 臨盤球岫 7Harper er M, 1993AH149 Conskct$ME

4、LI IMS弓I ll MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System J&Libianes U;er Manual(clontedi)曲LI TATAGA11 UASGAL2 瞄 GALHATA MELI UASMEM TATAJU EllMELI TATA所用表達載體信息如下引自 MATCHMAKER GAL4 Two-Hyb-rid Sy&tenn 3&Ub舊AH149 Conskct$MELI IMS弓I ll MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System J&Libianes U;er Manual(clontedi)曲LI TATAGA11

5、 UASGAL2 瞄 GALHATA MELI UASMEM TATAJU EllMELI TATA所用表達載體信息如下引自 MATCHMAKER GAL4 Two-Hyb-rid Sy&tenn 3&Ub舊ri晤山審 Mm#洲般四策h)H海 III*SVVtJLS pGADTZ wmd 8.0 hb HA 書 piiopoi巡Hindll 0伽IIImil 火，以Hi冏II|HIIpGBKn 5 7 3 kbpvc 0fi 酵母雙雜交技術(shù)優(yōu)點：高效:轉(zhuǎn)化方法簡單，轉(zhuǎn)化效率高，便于操作。靈敏可檢測蛋白質(zhì)之間的微弱作用。真 實:酵母細胞是真核細胞，融合蛋白之間的相互作用是在真核細胞核內(nèi)進行的,蛋

6、白質(zhì)經(jīng)過翻 譯后的修飾，多數(shù)可以保持蛋白質(zhì)的天然空間構(gòu)象和折疊狀態(tài)接近其真實的生理狀態(tài)，一定 程度上可代表其在細胞內(nèi)真實情況。簡捷:只需要構(gòu)建誘餌表達載體，可以省略蛋白質(zhì)抽提 純化或抗體制備的繁瑣步驟。酵母雙雜交服務(wù)內(nèi)容介紹：酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建：服務(wù)內(nèi)容：總RNA提取、純化一mRNA分離一cDNA制備一cDNA連接AD載體一連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌-cDNA文庫效價測定一cDNA文庫擴增一cDNA文庫擴增后的質(zhì)粒DNA純化一純化后cDNA 文庫質(zhì)量的鑒定（如PCR和酶切鑒定等方法）等合作方式：為客戶構(gòu)建指定的酵母雙雜交基因文庫。由客戶提供cDNA或組織、細胞等。服務(wù)完成時提供詳細的實驗報告

7、以及文庫酵母雙雜交技術(shù)從cDNA文庫中篩選相互作用蛋白：服務(wù)內(nèi)容：l誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及自激活作用和蛋白毒性檢測l組織cDNA文庫的構(gòu)建（或客戶提供）l酵母接合效率的計算及接合后初步陽性克隆篩選的統(tǒng)計l陽性克隆文庫質(zhì)粒的提取，轉(zhuǎn)化酵母后自激活作用檢測l酵母雙雜交篩選結(jié)果的質(zhì)粒回轉(zhuǎn)驗證結(jié)果l陽性克隆文庫質(zhì)粒的提取，轉(zhuǎn)化細菌，測序及登陸NCBI等網(wǎng)站進行序列比對，公布最 終篩選結(jié)果合作方式：為客戶對指定的基因文庫進行酵母雙雜交篩選，篩選完成后向客戶提供詳細的篩選報告和陽 性克隆實物，客戶需要提供誘餌基因信息。酵母雙雜交技術(shù)檢測指定蛋白對之間的相互作用：技術(shù)服務(wù)內(nèi)容：l誘餌蛋白表達載體與獵物蛋白表達載體

8、的構(gòu)建l表達載體轉(zhuǎn)化酵母的驗證及自激活活性，毒性檢測l誘餌蛋白質(zhì)粒與獵物蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母的驗證以及相互作用的檢測報告l 無相互作用時誘餌和獵物蛋白的表達情況的Western blotting檢測合作方式：為客戶對指定的2個或多個蛋白之間進行酵母雙雜交實驗，驗證其相互作用。由客戶提供基 因克隆，抗體，或從公司購買抗體。實驗完成后向客戶提供詳細的實驗報告和相互作用陽性 的酵母共轉(zhuǎn)化菌株。部分實驗案例圖示ioaob|i，海p 50Ob圖2. 4個C盛片段的PCR圖諸圖3一 4個?；騏S1片段誘餌載體 的酶切鑒定圖諸丑-b.p皿即5000 皿201075-u oooo o 0505Q 0752圖g

9、16種共轉(zhuǎn)化ORUSl誘餌載怵與。站適2 J獵物載體的酵母AH109菌落的PCR驗證5656Os02g5024096.89%67Os06g4064099.76%65Os02g4652022Os05g40180putative, expressed45Os04g5424038Os05g11320克隆編號相似序列登錄號蛋白功能描述相似百分比glutamine synthetase, catalytic domain containing protein,expressedfructose-bisphospatealdolaseisozyme, putative, expressedhydrolase, putative,expressed 95.22% serine/threonine-protein kinase stt7, chloroplast precursor,77.27%wou