多聚酶鏈式反應擴增片段經(jīng)典版

1、關(guān)于多聚酶鏈式反應擴增片段經(jīng)典版第1頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三DNA指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過案發(fā)現(xiàn)場的血液、頭發(fā)等樣品中提取的DNA，與犯罪嫌疑人的DNA進行比較，就由可能為案件的偵破提供證據(jù)。討論：1.犯罪嫌疑人留在現(xiàn)場的樣品一般都是極少量的，刑偵人員要怎樣才能得到足夠量的DNA呢？2.你還能說出DNA鑒定技術(shù)在其他方面的應用嗎？第2頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三分子生物學研究中最強大的實驗技術(shù)之一其本質(zhì)是在體外模擬細胞內(nèi)DNA分子復制的過程美國科學家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎

2、 第3頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一、基礎知識脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第4頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三一個核苷酸上的磷酸基團上的“OH”和另一個核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3和5碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3，5-磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“OH”末端稱為3端，而磷酸

3、基團的末端稱為5端3.脫氧核苷酸鏈的形成脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖第5頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三DNA分子的平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5端3端5端3端 識別 ：-OH端為3; 磷酸基團的末端為5。第6頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu).DNA分子是由 的（即一條鏈為35，另一條鏈為53）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則 結(jié)構(gòu)。. 與 交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架； 排列在鏈的內(nèi)側(cè)。.兩條鏈上的堿基通過 連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與 配對， 一定同胞嘧啶配對。雙螺旋兩條反向平行脫氧核

4、糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤第7頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三（1）DNA分子是由 的（即一條鏈為35，另一條鏈為53）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則 結(jié)構(gòu)。4.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點：（2） 與 交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架； 排列在鏈的內(nèi)側(cè)。（3）兩條鏈上的堿基通過 連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤（A）一定與 配對，鳥嘌呤（G）一定同 配對。兩條反向平行雙螺旋脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）第8頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三（二）DNA的復制：1.概念：由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過

5、程。2.時期：有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場所：細胞核（主要）、線粒體、葉綠體4.基本條件：酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈第9頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三5.復制特點：a.邊解旋邊復制b.半保留復制6.遵循原則：堿基互補配對原則7.精確復制的原因a.規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復制提供了精確的模板b.堿基互補配對保證了復制準確無誤的進行8.復制的意義:DNA分子通過復制將遺傳信息從親代傳給了后代，保持了遺傳信息的連續(xù)性。第10頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三參與的組分在DNA復制中的作用解

6、旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物總結(jié)：細胞內(nèi)DNA復制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸第11頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（ RNA）打開DNA雙鏈模板合成子鏈的原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3端開始連接脫氧核苷酸 思考：體外擴增DNA時，如何提供與體內(nèi)DNA復制相似條件？ 變性（ 80100 ）Taq DNA聚合酶（耐高溫）2030個核苷酸構(gòu)成DNA或RNA第12頁，共33頁，2022年，5月20日，19點4

7、5分，星期三二、PCR（多聚酶鏈式反應）（一）PCR原理DNA雙鏈變性（加熱80-100 ）復性（緩慢冷卻）DNA單鏈變性的目的：解開雙鏈復性的目的：有利于引物1和引物2與兩條單鏈的結(jié)合第13頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三PCR擴增儀PCR擴增儀實際上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器，它可以根據(jù)DNA的熱變性原理，通過自動改變溫度，達到擴增DNA片段的目的。第14頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸高溫變性低溫復性重復13步30輪DNA復制的方向：DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸變

8、性 復性（退火） 延伸（二）PCR的反應過程：第15頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三二、PCR的反應過程 5/3/3/5/5/3/引物5/3/引物變性95oC復性55oC延伸72oC5/3/3/5/第16頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三5引物15引物2第二次復制第一次復制55 55 5 5模板DNA55 555 5 552530 次循環(huán)（復制）后，模板DNA的含量可以擴大100萬（220）倍以上。第17頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三三、 PCR實驗操作1、PCR儀（一）設備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e

9、為0.5mL3、微量移液器 用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實質(zhì)上是能夠自動調(diào)控溫度的儀器第18頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三第19頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三4、離心機一種通過高速轉(zhuǎn)動產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開的設備。第20頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機上（離心）（5）將離心管放入PCR

10、儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序（反應）循環(huán)數(shù)變性復性延伸第一次94，5min30次94，30s55，30s72，1min最后一次4，1min55，30s72，1min（二）操作步驟：第21頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三四、 結(jié)果分析與評價DNA 含量的測定：稀釋 對照調(diào)零 測定 計算50倍蒸餾水做對照波長260nm處讀數(shù)第22頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算四、課題成果評價1 、一條DNA，復制n次， DNA為2 n2 、 a條DNA，復制n次， DNA為a x2 n（二）實驗中DNA含量的測定1 、原理 可

11、以通過測量DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)第23頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三光吸收波長nm2602402202800.10.2第24頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三2 、過程稀釋2L PCR反應液，加入98L蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100L至比色杯中，測定260nm處的光吸收值測定并計算DNA含量（g/mL）50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)第25頁，共33頁，2022年

12、，5月20日，19點45分，星期三50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1, DNA 的含量為50g /mL紫外分光光度計比色杯第26頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三體內(nèi)DNA復制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復制特點半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。半保留復制，完全解旋后復制，從模板鏈的一端開始復制。復制的方向子鏈的5端向 3端延伸子鏈的5端向 3端延伸第27頁，共33頁，20

13、22年，5月20日，19點45分，星期三課堂小結(jié)多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR原理DNA的復制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復性受溫度影響PCR過程變性復性延伸操作步驟配制PCR反應體系移入離心管放入PCR儀設置工作參數(shù)DNA擴增測定含量稀釋調(diào)零測定并讀數(shù)計算第28頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三練習鞏固：1.做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進行的關(guān)鍵步驟是 A.反復洗滌 B.不怕外源DNA污染 C.高壓滅菌 D.在-20儲存2.PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點是 A.原理簡單 B.原料易獲得 C.Taq DNA聚合酶有耐熱性 D.快速、高效、靈活、易于操作第29頁，共33頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三靶序列靶序列PCR 循環(huán)第一步：高溫變性第30頁，共33