基因組序列詮釋

1、關(guān)于基因組序列詮釋第1頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四問(wèn)題基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組作為一個(gè)整體如何行使其功能？用什么方法尋找基因、研究基因的功能呢？第2頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四1. 尋找基因1.1 根據(jù)開(kāi)放讀碼框預(yù)測(cè)基因A 起始密碼子 ATG第一個(gè)ATG的確定(依據(jù)Kozak規(guī)則); Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果. 所謂Kozak規(guī)則，即第一個(gè)ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計(jì)規(guī)律.第3頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四Kozak規(guī)則: 若將第一個(gè)ATG中的堿基A，T，G分別標(biāo)為1，2，3位

2、，則Kozak規(guī)則可描述如下：(1) 第4位的偏好堿基為G；(2) ATG的5端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3) 在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4) 除-3，-6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。第4頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四B 信號(hào)肽分析 信號(hào)肽分析軟件(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把預(yù)測(cè)過(guò)程中證實(shí)含完整mRNA 5端的序列翻譯為蛋白序列; 然后用SignalP軟件對(duì)前50個(gè)氨基酸序列(從第一個(gè)ATG對(duì)應(yīng)的甲硫氨酸Met開(kāi)始)進(jìn)行評(píng)估，如果SignalP分析給出正面結(jié)

3、果，則測(cè)試序列有可能為信號(hào)肽; 第5頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四 C 終止密碼子 終止密碼子: TAA, TAG,TGA GC% = 50% 終止密碼子每 64 bp出現(xiàn)一次； GC% 50% 終止密碼子每100200 bp 出現(xiàn)一次； 由于多數(shù)基因 ORF 均多于50個(gè)密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是 ORF 不少于100 個(gè)密碼子。第6頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四D 3端的確認(rèn) 3端的確認(rèn)主要根據(jù)Poly(A)尾序列,若測(cè)試DNA片段不含Poly(A)序列，則根據(jù)加尾信號(hào)序列“AATAAA”和BLAST同源性比較結(jié)果共同判斷。第7頁(yè)，共44

4、頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四E 非編碼序列、內(nèi)含子 高等真核生物多數(shù)外顯子長(zhǎng)度少于100 個(gè)密碼子，有的不到50個(gè)密碼子甚至更少；第8頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四F 密碼子偏愛(ài)性 編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其差別僅在密碼子的第3位堿基不同。 不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異，如人類基因中，丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。第9頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四 G 外顯子內(nèi)含子邊界 外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征， 如:內(nèi)含子的5端或稱供體位（donor site）常見(jiàn)的順

5、序?yàn)?5AGGTTAAGT-3； 3端又稱受體位（acceptor site), 多為5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；第10頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四 H 上游控制序列 幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，它們可與DNA結(jié)合蛋白作用，控制基因表達(dá)。 通過(guò)同源性比較來(lái)預(yù)測(cè)mRNA的5端，最常用的與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)是真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http:/www.epd.unil.ch/ )。 另外個(gè)別生物基因組的特有組

6、成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動(dòng)物基因組許多基因的上游都有CpG島。 第11頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四 I 軟件預(yù)測(cè) 采用NCBI的ORF預(yù)測(cè)軟件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi )判斷ORF的可能范圍。第12頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四 1.2 同源查詢途徑 通過(guò)已存入數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因順序與待查的基因組序列進(jìn)行比較，從中查找可與之匹配的堿基順序及其比例，用于界定基因的方法稱為同源查詢。 第13頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四同源有如下幾種情況： A DNA序列某些片段完全相同；B 開(kāi)放讀碼框（O

7、RF）排列類似，如有長(zhǎng)外顯子；C 開(kāi)放讀碼框翻譯成氨基酸序列的相似性；D 模擬多肽高級(jí)結(jié)構(gòu)相似第14頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四1.3 試驗(yàn)分析 Northern 雜交確定DNA片段是表達(dá)序列. 注意事項(xiàng)： a 當(dāng)某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行可變剪接時(shí)，由于連接的外顯子不同，會(huì)產(chǎn)生好幾條長(zhǎng)度不一的雜交帶; 如果該基因是某一基因家族的成員也會(huì)出現(xiàn)多個(gè)信息； b 考慮組織專一性和發(fā)育階段的問(wèn)題；第15頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四第16頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四第17頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四c 基

8、因表達(dá)產(chǎn)物豐度的問(wèn)題 如果風(fēng)度較低，用擬Northern 雜交和動(dòng)物雜交（Zoo-blotting）分析。 擬Northern 雜交 根據(jù)已知的DNA順序設(shè)計(jì)引物，從mRNA群體中擴(kuò)增基因產(chǎn)物，再以DNA為探針與之雜交。第18頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四動(dòng)物園雜交 根據(jù)親緣關(guān)系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低的原理。如果某一物種的DNA 順序與來(lái)自另一親緣物種的DNA片段雜交產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，該區(qū)段可能含有1個(gè)或多個(gè)基因，這種方法又稱為動(dòng)物園雜交。第19頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四第20頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月2

9、0日，6點(diǎn)3分，星期四2 獲取基因全長(zhǎng)cDNA序列A 構(gòu)建cDNA文庫(kù)，用目的基因DNA片段篩選文庫(kù)。第21頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四cDNA文庫(kù)構(gòu)建(CLONTECH)第22頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四cDNA文庫(kù)構(gòu)建第23頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四B 根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)引物，RACE 技術(shù)得到基因的全長(zhǎng)cDNA序列。 第24頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四5RACE(CLONTECH)第25頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四3RACE(CLONTECH)第26頁(yè)，共44

10、頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四第27頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四第28頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四3.確定DNA序列中基因的位置A 通過(guò)對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列的測(cè)序、對(duì)比，以及與基因組DNA的比較，確定基因所在的區(qū)域；B 通過(guò)物種已建立遺傳圖和物理圖來(lái)確定基因的位置；第29頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四4.實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能4.1 基因剔除(knock-out) 最簡(jiǎn)便的基因失活的方法. 主要原理: 在一段無(wú)關(guān)DNA 片段的兩側(cè)連接與代換基因兩側(cè)相同的序列,將這一構(gòu)建導(dǎo)入目的細(xì)胞,由于同源片段之間的重組,可使無(wú)

11、關(guān)片段取代靶基因,整合到染色體中.為了便于篩選,用于取代的外源DNA中含有報(bào)告基因. 第30頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四4.2 基因超表達(dá) 通過(guò)增加基因的拷貝數(shù)和采用強(qiáng)啟動(dòng)子促使基因超表達(dá),致使受體表現(xiàn)出生長(zhǎng)與發(fā)育的異常,來(lái)研究基因的功能.第31頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四 4.3反義RNA 反義RNA是由基因的負(fù)鏈編碼,可與正義RNA (sense RNA)或DNA 編碼順序結(jié)合,干擾mRNA 的轉(zhuǎn)錄,加工和轉(zhuǎn)運(yùn),調(diào)控基因的表達(dá).第32頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四構(gòu)建反義RNA 表達(dá)載體: 將全目的基因或部分目的基

12、因反向插入表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物 獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體或品系 分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異 判別目的基因的功能第33頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四正義表達(dá)載體反義表達(dá)載體第34頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四反義RNA 作用機(jī)理： A 干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細(xì)胞降解。 B 與mRNA 的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使翻譯無(wú)法啟動(dòng)。 C 反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RNA多聚酶脫離模板,轉(zhuǎn)錄終止。第35頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四4.4 RNAi干涉

13、 RNAi干涉是通過(guò)雙鏈RNA的介導(dǎo),特異性地降解相應(yīng)序列的mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制.第36頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四RNAi 作用機(jī)理A dsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成2125 個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA鏈;B 這些小片段RNA(siRNA)作為另一個(gè)核糖核酸復(fù)合體RISC(RNA-induce silencing complex,RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的指引物,結(jié)合到RISC上,使之識(shí)別并降解mRNA,從而導(dǎo)致與雙鏈RNA同源的基因沉默;第37頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四第38頁(yè)，共4

14、4頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四RNAi設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用A Fraser 合成與開(kāi)放讀碼框相對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA或利用細(xì)菌克隆表達(dá)這些雙鏈RNA微量注射和喂食干擾同源基因的表達(dá)B Chuang 等設(shè)計(jì)出嵌合體結(jié)構(gòu) 連接強(qiáng)啟動(dòng)子大量表達(dá)雙鏈mRNA干擾同源基因的表達(dá)第39頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四HbF基因的RNAi載體構(gòu)建第40頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四RNAi技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)RNAi最根本的特點(diǎn)是特異性RNAi具有特殊的穿越能力,如將雙鏈RNA注射在線蟲性腺里,它也會(huì)干擾到體細(xì)胞里的基因表達(dá),而且干擾作用會(huì)傳給后代;RNAi對(duì)一些低水平表達(dá)的基因的RNAi現(xiàn)象并不明顯,而且?guī)讉€(gè)有相同或相似序列的基因, RNAi也會(huì)同時(shí)作用與它們.第41頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四4.5 酵母雙雜交（yeast two-hybridization）原理： 其原理涉及轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子之間的互作。 正常條件下： 轉(zhuǎn)錄因子 （包括兩個(gè)功能區(qū)域） 結(jié)合功