兔瘟組織滅活苗的制作

1、兔病的綜合診斷王海榮第一頁，共二十九頁。流行病學診斷 臨床診斷 病理診斷第二頁，共二十九頁。 微生物(Microorganism) 形體微小、結(jié)構(gòu)簡單，須借助于光學顯微鏡或電子顯微鏡進行觀察。 病毒(包括噬菌體)； 細菌、放線菌、立克次氏體、支原體、衣原體、螺旋體等； 真菌：包括酵母菌（單細胞）、霉菌（多細胞）； 單細胞的藻類以及原生動物等。非細胞型微生物單細胞原核微生物真核微生物第三頁，共二十九頁。 細菌(bacteria)的細胞形態(tài) 1、球菌 單獨存在時為圓球形，幾個細菌聯(lián)在一起時其接觸面稍為扁平。按其分裂方向和分裂后排列狀態(tài)，可以分為：單球菌、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、鏈球菌、葡萄球菌

2、。2、桿菌 細胞呈桿狀或圓柱狀，各種桿菌的長度與直徑比例差異很大，有的粗短，有的細長，短桿菌近似球狀，長桿菌近似絲狀。一般來說，同一種桿菌其粗細比較穩(wěn)定，而長度則經(jīng)常因培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件不同而有較大變化。有的桿菌很直，有的稍彎，有的兩端截平如炭疽芽孢桿菌，有的略尖，有的半圓。 第四頁，共二十九頁。 （三）革蘭氏染色 革蘭氏染色法于1884年由丹麥醫(yī)生Gram創(chuàng)立，是延用至今的經(jīng)典染色法。 經(jīng)革蘭氏染色后可以把全部細菌分為G+和G-兩大類。 染色機制：與細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成有很大關(guān)系。 G+細菌：肽聚糖層厚，含量多，經(jīng)乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結(jié)晶紫與碘的復合物保留在細胞內(nèi)而不被

3、脫色，復染后不著色，保持結(jié)晶紫的顏色； G-細菌：肽聚糖層很薄，含量少，脂肪含量高，經(jīng)乙醇處理后部分細胞壁脂類可能被溶解并改變其組織狀態(tài)，細胞壁孔徑變大或通透性增加，不能阻止溶劑透入，酒精將結(jié)晶紫與碘的復合物洗脫，細菌被脫色，經(jīng)復染后染成紅色。 第五頁，共二十九頁。細胞壁革蘭氏陽性菌 (G+)革蘭氏陰性菌 (G-)厚度與強度厚、致密、堅韌薄、疏松肽聚糖數(shù)量、含量多層、含量高、占細胞干重4090%單層、含量低、占細胞干重510%脂類含量少、占細胞干重1-4%多、占細胞干重11-22%磷壁酸（垣酸）+-脂多糖、磷脂、脂蛋白-+肽聚糖脂蛋白磷壁酸外膜第六頁，共二十九頁。染色操作步驟涂片固定滴生理鹽水

4、挑取菌苔一環(huán)涂片熱固定干燥取菌液一環(huán)涂片干燥第七頁，共二十九頁。革蘭氏染色法1. 涂片、干燥及固定2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1-2分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4. 脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約25秒，后立即用流水沖洗。5. 復染：滴加番紅染色液，染2分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 6. 鏡檢：觀察染色結(jié)果圖。第八頁，共二十九頁。細水沖洗結(jié)晶紫初染2min碘液媒染1min95%酒精脫色 20s蕃紅復染 12min細水沖洗細水沖洗第九頁，共二十九頁。 革蘭氏染色成敗關(guān)鍵： 酒精脫色，脫

5、色不夠?qū)-轉(zhuǎn)變?yōu)镚+，脫色過度將G+變成G-； 涂片要均勻、??； 菌齡影響染色，菌齡老、陳舊的細菌培養(yǎng)物，往往G+轉(zhuǎn)變成G-，一般做革蘭氏染色用18小時左右的細菌培養(yǎng)物，不要超過24小時，以免影響染色性。第十頁，共二十九頁。油鏡操作規(guī)程1. 先用低倍鏡和高倍鏡觀察涂片，待看到目的物后，將其移到視野中央。2. 在涂片上滴一滴香柏油，轉(zhuǎn)動換轉(zhuǎn)器使油鏡針對通光孔。3. 使油鏡與香柏油接觸，這時油鏡頭幾乎與載玻片相接觸，切記不能使用粗調(diào)，以免壓碎載玻片。4. 用細調(diào)旋鈕慢慢提升鏡頭高度，直至物像清晰。切勿擰反方向。5. 觀察完畢后，使鏡筒遠離載物臺。取下載玻片。用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油：先用干的擦

6、鏡紙擦12次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦2次，最后再用干擦鏡紙擦1次。擦拭時要順鏡頭的直徑方向，不要沿鏡頭的圓周擦。擦拭要細心，動作要輕 。 第十一頁，共二十九頁。五、結(jié)果： 繪模式種、自選種鏡檢油鏡視野圖（比例、形狀準確，注放大倍數(shù)，染色特性）G+ (金黃色葡萄球菌)G-（枯草芽孢桿菌）G-（大腸桿菌）第十二頁，共二十九頁。Gram Stain of Staphylococcus aureusGram Stain of Escherichia coliA Gram Stain of a Mixture of Gram-Positive and Gram-Negative Bac

7、teria.第十三頁，共二十九頁。 兔病毒性出血癥的診斷及其組織滅活苗的制造王海榮第十四頁，共二十九頁。 兔的病毒性出血癥（rabbit viral hemorrhagic diseaze）是兔的一種急性敗血性傳染病，RHDV抗原性強，組織滅活苗效果極佳，安全可靠，目前廣泛使用的是肝組織甲醛滅活苗，聯(lián)苗兔瘟、巴氏桿菌二聯(lián)苗也已使用。第十五頁，共二十九頁。 組織滅活苗可分加佐劑和不加佐劑兩種。含佐劑苗所產(chǎn)生的抗體水平較高于無佐劑苗，但產(chǎn)生免疫力的時間遲于無佐劑苗，而且生產(chǎn)程序較為復雜，成本也高。 當發(fā)生免瘟時，作為緊急接種，選用無佐劑苗更為理想，因產(chǎn)生免疫力較快，可提早控制疫情，即使平時預防接種

8、，無佐劑苗也極為有效。第十六頁，共二十九頁。一 材料 （1）種毒 強毒株組織毒1:10懸液感染成兔肌注1ml，4872小時引起發(fā)病死亡。（2）制苗動物 3月齡以上未感染本病和未接種本病疫苗的健康免。 組織搗碎機等第十七頁，共二十九頁。二、操作方法1、攻毒取種毒2-5g制成1:10組織懸液，每毫升各加青鏈霉素1000IU單位,在4處理46小時，取上清液皮下或肌肉注射兔子，1ml/只，實驗免接毒后的觀察。第十八頁，共二十九頁。（1）抗生素可先配制成高濃度的原液， -20保存。（2）抗生素的最高使用濃度。 青霉素鉀1萬單位/ml 鏈霉毒鉀：20mg/ml即 1mg=1000Iu 2萬Iu/ml。 抗

9、生素的配置： 1先配濃溶液20萬/ml，25萬/ml第十九頁，共二十九頁。2、RHD的臨床診斷及實驗室診斷臨床上，RHD以神經(jīng)癥狀為主，在免疫壓力可表現(xiàn)出非典型變化。剖檢以呼吸系統(tǒng)的嚴重出血和內(nèi)臟實質(zhì)器官的淤血腫大為特征。人工感染后的發(fā)病高峰時間 接種后3672小時。第二十頁，共二十九頁。RHDV可凝集人的O型紅細胞，溫度對血凝無顯著影響，PH4.4-7.2時血凝穩(wěn)定，血凝具有特異性，能被高免血清所抑制。 第二十一頁，共二十九頁。 10%肝懸液4000rpm，10-15分鐘離心后取上清，1%人O型紅細胞做HA，放置20-30分鐘出結(jié)果，血凝現(xiàn)象的觀察時間不超過45分鐘。 HA1160即為陽性

10、陽性病料無論是自然死亡還是人工感染致死，其血凝價一般不低于25。 健康兔只有2223，24。第二十二頁，共二十九頁。RHD組織滅活苗的制造與檢驗 病料：PBS=1:10，生理鹽水也可。搗碎、濾過，加入甲醛，使之含0.4%，371224小時，搖勻/2小時。 用0.8%甲醛生理鹽水對倍稀釋，分裝，37溫箱內(nèi)滅活48小時，每2小時搖勻一次，備檢。第二十三頁，共二十九頁。方 法： 100g+400ml滅菌生理鹽水高 速組織、搗碎碎機勻漿（13）過濾用0.8%甲醛生理鹽水對倍稀釋分裝37溫箱內(nèi)滅活24小時，每2小時搖勻一次，備檢。第二十四頁，共二十九頁。檢驗： 安全檢驗：23倍接種量1ml3ml(血液瓊脂斜面，厭氧肉肝湯) 無菌檢驗：培養(yǎng)基接種。 效力檢驗：第二十五頁，共二十九頁。 效力檢驗： 試驗：對照：710天產(chǎn)生免疫力攻毒。對照免三分之二或100%死亡。 保護率應(yīng)80%第二十六頁，共二十九頁。 4、免疫期測定 5、疫菌的保存4 25 保存6個月第二十七頁，共二十九頁。七 思考題 1 兔瘟的病變有哪些？ 2 如何制備兔瘟組織滅活苗？第二十八頁，共二十九頁。內(nèi)容總結(jié)兔病的綜合診斷。革蘭氏染色法于1884年由丹麥醫(yī)生