多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)課件

1、多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) LDL多抗鑒定及效價(jià)測定實(shí)驗(yàn)二、免疫濁度測定 免疫球蛋白檢測 2多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)一、本次實(shí)驗(yàn)的目的：1、掌握可溶性抗原制備抗血清鑒定的常用方法。2、掌握雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法。3、掌握抗體效價(jià)的判斷。4、掌握免疫濁度的測定原理。5、熟悉免疫球蛋白檢測的臨床意義。3多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)沉淀反應(yīng)（precipitation） 可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合所出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。4多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)分類液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)免疫濁度測定凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)免疫擴(kuò)散免疫電泳單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)火箭免疫電泳對

2、流免疫電泳沉淀反應(yīng)5多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)思考：抗原抗體反應(yīng)的四大特點(diǎn)？特異性 可逆性比例性 階段性6多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)抗原為可溶性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段：第一階段、抗原抗體特異性結(jié)合(不可見)第二階段、形成可見的免疫復(fù)合物（可見） 條件 電解質(zhì)，溫度，酸堿度 7多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)(gel phase precipitation) 主要是指瓊脂糖擴(kuò)散或稱凝膠擴(kuò)散(gel diffusion)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。8多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c方法不同，可將固相內(nèi)沉淀驗(yàn)分為2類：（一）免疫擴(kuò)散 單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

3、(single gel diffusion test) 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) (double gel diffusion test)（二）凝膠免疫電泳(gel immuno-electrophoresis)火箭免疫電泳雙擴(kuò)散免疫電泳9多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(一) 原理 將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測的抗原物質(zhì)在凝膠中自由擴(kuò)散，與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。10多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)(二) 操作步驟（平板法）1.將抗體和0.9%瓊脂糖50-56混合,即刻傾注成平板。2.待凝固后在瓊脂板上打孔,孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液。3.置37

4、,讓其向四周自由擴(kuò)散,24-48h后可見其孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。11多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)單向輻射狀免疫擴(kuò)散上排為5個(gè)不同的參考，中、下排為患者血清，下排右2為一異常病理血清12多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)(三) 方法評(píng)價(jià) 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是一種穩(wěn)定、簡便、毋需特殊設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室均可使用的常規(guī)方法，試驗(yàn)的重復(fù)性和線性均好。敏感度為1.25mg/L13多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)(四) 影響因素1. 抗原分子量 抗原分子量大，擴(kuò)散慢，沉淀環(huán)較小；抗原分子量小，擴(kuò)散快，沉淀環(huán)相對較大。要求待檢血清和抗原標(biāo)準(zhǔn)品在血清學(xué)上具有均一性，否則可能出現(xiàn)結(jié)果偏高或偏低。 2. 抗體種類 實(shí)驗(yàn)證明兔抗血清優(yōu)于馬、羊抗血清，兔抗血清

5、可測抗原0.11IU/ml，馬抗血清為110IU/ml，羊?yàn)?.44IU/ml，為提高實(shí)驗(yàn)敏感度，應(yīng)首選敏感度高的抗血清。14多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)3. 抗體稀釋度 抗體濃度大，沉淀環(huán)小，則敏感度低；抗體濃度小，沉淀環(huán)增大，不同濃度抗原間的差別較顯著，敏感度高。但沉淀環(huán)過大，常造成邊緣糊不清，致使測量誤差也增大。因此要求在沉淀環(huán)清晰的基礎(chǔ)上加大稀釋度以提高敏感度。15多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(一) 原理 將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應(yīng)孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇，在比例合適時(shí)形成可見的白色沉淀線。沉淀線的特征與抗原抗體的濃度、純度和擴(kuò)散速率等有關(guān)

6、。16多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)(二) 操作步驟（平板法）融化瓊脂，澆板 每張載玻片約4ml。凝固，打孔 孔徑3mm，孔間距35mm，孔型有雙孔型、三角孔型、雙排孔型和梅花孔型。加樣 在相對孔內(nèi)加抗原或抗體。孵育 使抗原抗體自由擴(kuò)散，在兩孔之間抗原抗體相遇，在比例適時(shí)形成可見的沉淀線。沉淀線的數(shù)目、形態(tài)和位置與抗原和抗體的純度、濃度和擴(kuò)散速度有關(guān)。17多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)18多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)(三) 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的應(yīng)用1. 檢測未知抗原或抗體及其相對含量 將已知的抗體或抗原與待檢標(biāo)本加入成對孔中根據(jù)沉淀線有無定性；根據(jù)沉淀線的位置估計(jì)抗原或抗體的相對含量根據(jù)沉淀弧形狀判斷抗原或抗體的相對擴(kuò)散速

7、率。19多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)沉淀線形狀、位置與抗原抗體擴(kuò)散率及濃度的關(guān)系A(chǔ)：Ag、Ab濃度及擴(kuò)散率近似；B：Ag、Ab濃度近似，擴(kuò)散率Ag Ab ；C：Ag、Ab濃度近似，擴(kuò)散率Ag Ab ；D：擴(kuò)散率近似，濃度Ag Ab ；E：濃度Ag Ab，擴(kuò)散率Ag Ab ；F：濃度Ag Ab，擴(kuò)散率Ag Ab20多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)2. 抗原性質(zhì)分析 利用三角孔型，將待檢抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原加入相鄰兩個(gè)孔中，與另一孔相對，根據(jù)沉淀線形狀分析待測抗原，見圖 。21多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn) 三種擴(kuò)散基本圖型22多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)3. 抗體效價(jià)滴定 用梅花型孔，中間放抗原，周圍孔放下不同稀釋度的相應(yīng)抗體，以出現(xiàn)沉淀

8、線的最高稀釋倍數(shù)為該抗體的效價(jià)。23多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn) 效價(jià)檢測結(jié)果該圖是經(jīng)過一次基礎(chǔ)免疫，三次加強(qiáng)免疫，間隔七天之后，頸動(dòng)脈取血所得血清測定的效價(jià)。免疫雙擴(kuò)散測效價(jià)，加樣方式同上，從圖中可以看出最后測得的效價(jià)分別為： 1：256，1：128，1：128中間孔抗原； 周圍孔血清血清的稀釋倍數(shù)分別為：孔11/8； 孔21/16； 孔31/32；孔41/64； 孔51/128； 孔61/25665432124多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)4. 抗體或抗原純度鑒定用混合抗原或抗體鑒定抗體或抗原，出現(xiàn)一條沉淀線說明待測抗原或抗體純，出現(xiàn)多條說明不純。25多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)雙擴(kuò)散試驗(yàn)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡單易行，用途

9、廣泛缺點(diǎn)：技術(shù)靈敏度低，出現(xiàn)結(jié)果慢，不能精確定量。26多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)經(jīng)典的沉淀試驗(yàn)有4個(gè)缺點(diǎn)無法克服：操作繁瑣敏感度低（10100g/ml）時(shí)間長難以自動(dòng)化27多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)免疫濁度測定（一）基本原理： 免疫濁度測定的基本原理是：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過量且固定時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計(jì)算出受檢物的含量。28多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)（二）類型透射免疫比濁法散射免疫比濁法免疫膠乳比濁法 29多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)30多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)1 透射免疫比濁法原理： 抗原抗體

10、在一定緩沖液中形成免疫復(fù)合物(IC)，當(dāng)光線透過反應(yīng)溶液時(shí)，由于溶液內(nèi)復(fù)合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復(fù)合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和復(fù)合物的量成正比，當(dāng)抗體量固定時(shí)，與待檢抗原量成正比。用抗原標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可測出待檢抗原含量。31多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)：優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度比單擴(kuò)法高510倍； CV小于10； 操作簡便快速，1h可報(bào)告結(jié)果； 結(jié)果準(zhǔn)確，且能用全自動(dòng)化或半全自動(dòng)化儀器進(jìn)行分析，尤其隨著膠乳粒子增強(qiáng)濁度測定法的出現(xiàn)，使敏感度提高，其應(yīng)用更加廣泛。缺點(diǎn)：抗體用量較大；檢測需抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡，耗時(shí)較長；不宜用于藥物等半抗原

11、的測定；靈敏度較散射比濁法低。32多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)3 免疫膠乳比濁法原理 選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，則發(fā)生凝集，單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光線可透過，當(dāng)兩個(gè)膠乳凝集時(shí)，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。34多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)（a）帶抗體的膠乳在波長之內(nèi)可透過光線；（b）結(jié)合后，則形成光線衰減35多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià) 敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應(yīng)液中無PEG沉淀劑的影響，個(gè)體IC對結(jié)果影響也小，所以結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設(shè)備，一般分光光度計(jì)、自動(dòng)化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。 36多抗制備

12、免疫比濁實(shí)驗(yàn)總評(píng)價(jià)缺點(diǎn)： 測定結(jié)果與儀器的性能和試劑的質(zhì)量密切相關(guān)，特別對抗體的質(zhì)量要求高，儀器和試劑價(jià)格比較貴。優(yōu)點(diǎn)：自動(dòng)化快速(3060s)靈敏(g/L)準(zhǔn)確精密度高(CV5)穩(wěn)定性好節(jié)省試劑檢測范圍廣不需減去樣本和試劑本底值等優(yōu)點(diǎn)。37多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)(三)免疫比濁法主要影響因素抗原抗體比例抗體的質(zhì)量抗原抗體反應(yīng)的溶液增濁劑的使用38多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)1 抗原抗體比例高劑量鉤狀效應(yīng)（high dose hook effect )海德堡（heidelberger）曲線理論39多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)40多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)41多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)2 抗體的質(zhì)量（1）特異性高（2）效價(jià)高（3）親和力高（4）抗血清來源42多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)3 抗原抗體反應(yīng)的溶液pH 6.58.5電解質(zhì) 離子強(qiáng)度、種類（磷酸鹽緩沖液）43多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)4 增濁劑的使用PEG、tween-20等非離子型親水劑作用：消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復(fù)合物。44多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) LDL多抗鑒定及效價(jià)測定實(shí)驗(yàn)二、免疫濁度測定 免疫球蛋白檢測 45多抗制備免疫比濁實(shí)驗(yàn)血清的采集與處理取血