教材拓展：基因工程的基本操作程序

1、PAGE3基因工程的基本操作程序拓展點(diǎn)一標(biāo)記基因和標(biāo)記基因的作用課本上提到運(yùn)載體要有標(biāo)記基因，其作用是供重組DNA鑒定和篩選，那么怎樣利用標(biāo)記基因進(jìn)行鑒定和篩選呢請(qǐng)同學(xué)們閱讀下面一段文字：運(yùn)載體中所攜帶的一些抗性基因（如氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因）及發(fā)光基因等，能控制一些特殊物質(zhì)的合成，利用這些特殊物質(zhì)可以篩選運(yùn)載體或重組運(yùn)載體，這些基因就叫做標(biāo)志基因。在用限制酶切割目的基因和運(yùn)載體、表達(dá)載體構(gòu)建及將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，這一系列過程都是在人為控制條件下，在有關(guān)酶的作用下自行完成的，而不是人為條件下一個(gè)一個(gè)處理的，是很多對(duì)象同時(shí)進(jìn)行的，這樣，就會(huì)出現(xiàn)有的運(yùn)載體被限制酶切割開，有的運(yùn)載體

2、沒有被限制酶切割開，沒有被限制酶切割開的運(yùn)載體，就不可能連接目的基因，只有被限制酶切開的運(yùn)載體才有可能拼接目的基因。我們就必須選擇出連接目的基因的重組運(yùn)載體（即表達(dá)載體），然后進(jìn)行擴(kuò)增，得到大量的表達(dá)載體。然后把大量的表達(dá)載體和大量的受體細(xì)胞放在一起，在一定的人為條件下，讓其自行導(dǎo)入受體細(xì)胞，這樣，在導(dǎo)入受體細(xì)胞時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)有的受體細(xì)胞被導(dǎo)入了表達(dá)載體，有的細(xì)胞沒有導(dǎo)入表達(dá)載體，我們?cè)龠x出含有表達(dá)載體的受體細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)。在上述過程中要進(jìn)行兩步篩選，一是篩選含有運(yùn)載體的受體細(xì)胞，其過程是在含有相應(yīng)抗菌素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有獲得運(yùn)載體的受體細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)，這樣便可篩選出含有運(yùn)載體的受體細(xì)

3、胞。二是篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，其過程是從每個(gè)菌落取一部分再接種到含另一種抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，由于目的基因插入該標(biāo)記基因中，致使該基因不能表達(dá)，因而受體細(xì)胞不能在含該抗生素的培養(yǎng)基上生存，據(jù)此可以從該菌落剩余部分的菌體中篩選出含目的基因的受體細(xì)胞。注意：在基因操作的基本步驟中要進(jìn)行多次篩選。拓展點(diǎn)二從基因文庫(kù)中找到所需要的基因從基因文庫(kù)中找到目的基因是一件比較復(fù)雜的事情，要根據(jù)目的基因已有的某些信息來(lái)進(jìn)行。下面介紹一種根據(jù)基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。第一步，通過PCR方法將目的基因已知的部分核苷酸序列擴(kuò)增出來(lái)，進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記（也可以用別的標(biāo)記方法進(jìn)行，如生物素、熒光素等

4、），即用標(biāo)記了放射性同位素的目的DNA片段作為探針，與擴(kuò)增出來(lái)的DNA雜交。第二步，將基因文庫(kù)中的所有菌落轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上（也可以用其他類型的膜），然后，通過處理溶解消化掉細(xì)菌中的蛋白質(zhì)，并使DNA固定在膜上。第三步，按Southern雜交的方法進(jìn)行雜交。第四步，在X光底片上出現(xiàn)黑斑的菌落，這表明這個(gè)菌落中含有所需要的目的基因（若選用別的標(biāo)記方法，有陽(yáng)性信號(hào)的菌落則含有所需要的目的基因）。第五步，從該菌落中再提取目的基因。拓展點(diǎn)三PCR的擴(kuò)增過程PCR擴(kuò)增是獲取目的基因的一種非常有用的方法，也是進(jìn)行分子鑒定和檢測(cè)的一種很靈敏的方法。PCR的擴(kuò)增反應(yīng)過程包括以下幾個(gè)主要過程。第一步：將反應(yīng)體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等）加熱至9095，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板。第二步：將反應(yīng)體系降溫至5560，使兩種引物分別與模板DNA鏈3端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對(duì)，這個(gè)過程稱為復(fù)性。第三步：將反應(yīng)體系升溫至7075 上述三步反