1、實(shí)驗(yàn)方法總結(jié)（1）：基因操作工具

1、實(shí)驗(yàn)方法總結(jié)（1）：基因操作工具 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc436388309 1、基因A（GeneA）的敲減載體構(gòu)建 PAGEREF _Toc436388309 h 1 HYPERLINK l _Toc436388310 2、GeneA過表達(dá)載體構(gòu)建 PAGEREF _Toc436388310 h 1 HYPERLINK l _Toc436388311 3、GeneA點(diǎn)突變載體構(gòu)建 PAGEREF _Toc436388311 h 1 HYPERLINK l _Toc436388312 4、GeneA敲除載體構(gòu)建（CRISPR/Cas9法） PAGEREF

2、 _Toc436388312 h 2 HYPERLINK l _Toc436388313 5、GeneA敲除載體構(gòu)建（TALENs 法） PAGEREF _Toc436388313 h 2 HYPERLINK l _Toc436388314 6、GeneA的miRNA載體表達(dá)構(gòu)建 PAGEREF _Toc436388314 h 21、基因A（GeneA）的敲減載體構(gòu)建版本1：針對GeneA，在Sigma網(wǎng)站上搜索已驗(yàn)證過敲減效率的shRNA序列，合成后兩端加上酶切位點(diǎn)，合成雙鏈DNA oligo，成為含干擾序列的具對應(yīng)粘性末端的shRNA表達(dá)框架。以EcorI和BamHI內(nèi)切酶酶切pEGFP載

3、體以使其線性化，形成不對稱的粘性末端。將shRNA表達(dá)框架插入pGP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆行PCR鑒定與測序，構(gòu)建含有針對GeneA的shRNA骨架質(zhì)粒。版本2：從Genebank調(diào)取人GeneA核苷酸序列，利用Ambion數(shù)據(jù)庫軟件設(shè)計(jì)針對GeneA的有效的shRNA序列，經(jīng)Blast 比對進(jìn)行同源性分析后，選出特異性較高的3 組分別命名，以可以被任意替換的莖干發(fā)夾結(jié)構(gòu)作為陰性對照。取pEGFP shRNA載體15L 于EP 管， 用BamHI 1.5L 與EcoRII 1.5L、10buffer 5L 酶切反應(yīng)4 h 以上；產(chǎn)物回收加入T4 DNA Ligase 使GeneA

4、shRNA 片段與目的載體連接，連接產(chǎn)物加入至DH5感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化；用高純質(zhì)粒小量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，同時(shí)挑取陽性克隆行PCR 鑒定、DNA 測序。2、GeneA過表達(dá)載體構(gòu)建從Pubmed Nucleotide數(shù)據(jù)庫中檢索針對目的基因的CDS序列，將序列導(dǎo)入DNAMAN軟件中，進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析；在該序列中不包含的酶切位點(diǎn)中，選擇克隆載體上多克隆位點(diǎn)中有的兩個(gè)限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacII。引物直接在GeneA CDS編碼區(qū)起始和末端設(shè)計(jì)，然后在引物的5端加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因片段，電泳膠回收目的片段后用其兩端酶切位點(diǎn)處理片段并純化回收。以同樣的酶切位點(diǎn)處理

5、pCDH載體以使其線性化，膠回收載體后與片段連接并轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR鑒定陽性克隆并測序。3、GeneA點(diǎn)突變載體構(gòu)建版本1：根據(jù)突變位點(diǎn)特異性設(shè)計(jì)突變寡核苷酸引物并合成含突變位點(diǎn)且互補(bǔ)的兩條引物。在PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 聚合酶的作用下，合成整個(gè)含有突變位點(diǎn)的質(zhì)粒。在反應(yīng)液中加入Dpn I 顯著性內(nèi)切酶，37 1 h。Dpn I 只能切斷腺嘌呤甲基化的DNA， 能將含有甲基化的原始模板消化，留下沒有甲基修飾的突變質(zhì)粒。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌。PCR 所得的突變質(zhì)粒的缺口能在大腸桿菌中得到修復(fù)，所獲得的菌落即含有突變質(zhì)粒。版本2：使用Hief

6、f Mut Site-Directed Mutagenesis Kit定點(diǎn)突變試劑盒構(gòu)建GeneA點(diǎn)突變載體。針對需引入突變的區(qū)域設(shè)計(jì)含突變位點(diǎn)的引物，將質(zhì)粒進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與DpnI混合，置于37恒溫反應(yīng)12小時(shí)進(jìn)行消化，去除甲基化模板質(zhì)粒。配制含有Exnase的單點(diǎn)突變重組反應(yīng)體系。置于37反應(yīng) 30 min。待反應(yīng)完成后，立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻5 min。取20 l冷卻反應(yīng)液，加入到200 l感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，隨后取100 l菌液均勻涂布在含有適當(dāng)抗生素的平板上，長出來的陽性克隆PCR，測序鑒定。4、GeneA敲除載體構(gòu)建（CRISPR/Cas9法）從NCBI數(shù)據(jù)庫

7、中查詢GeneA的CDS序列，在外顯子中確定待敲除的序列，選擇23-250bp的外顯子序列輸入軟件中，進(jìn)行特異sgRNA設(shè)計(jì)，根據(jù)輸出的sgRNA模板序列，合成一對序列互補(bǔ)的DNA Oligos。將合成的Oligos以逐步降溫的方法退貨成雙鏈，然后與Cas9質(zhì)粒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，涂板，陽性克隆測序，正確的陽性克隆，小抽后獲得含shRNA表達(dá)元件的Cas9質(zhì)粒。錯(cuò)配酶法檢測剪切活性：靶序列PCR擴(kuò)增后經(jīng)變性、退火，將形成錯(cuò)配。錯(cuò)配酶（CEL1或T7E1酶）將識別錯(cuò)配的雜合雙鏈并剪切。產(chǎn)物跑電泳，比較切割條帶與未切割條帶的比例，判斷Cas/sgRNA的活性。5、GeneA敲除

8、載體構(gòu)建（TALENs 法）TAL效應(yīng)因子（TAL effector, TALE）具有序列特異性結(jié)合能力，通過將FokI核酸酶與一段人造TALE連接起來，形成了一類具有特異性基因組編輯功能的強(qiáng)大工具，即TALEN。利用 TALEN 技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因組定點(diǎn)修飾的流程包括以下幾個(gè)步驟。第一步，從選定的目標(biāo)序列中尋找合適的 TALE 候選靶位點(diǎn)，選擇的 DNA 序列 5 端第一個(gè)堿基最好為 T。為了能快速獲得合適的 TALE 候選靶位點(diǎn)，目前已經(jīng)建立了多個(gè)在線軟件：(1) ；(2).sa；(3) /ZiFiT ;（4）/TALENT/help.php。第二步， 獲取針對 靶 序 列 的 特 異TALE

9、蛋白。這一步是 TALEN 技術(shù)最為重要和復(fù)雜的一步，目前已經(jīng)有多篇文章報(bào)道了改進(jìn)后的獲取 TALEN 的方法 18-22。第三步，選擇合適的 FokI結(jié)構(gòu)域，利用分子生物學(xué)的方法把 TALE 和 FokI組裝在一起構(gòu)建完整的 TALEN 蛋白。第四步，將完整的 TALEN 引入細(xì)胞進(jìn)行基因組定點(diǎn)修飾操作。第五步，篩選陽性克隆，評價(jià)效果。以上并不是每個(gè) TALEN 必經(jīng)的步驟，有的會在第三步與第四步之間加入酵母雙雜交等評估，首先確定其活性，然后再用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法：根 據(jù)TALEN 靶點(diǎn)選擇的原則和文獻(xiàn)的報(bào)道，針對 GeneA的第一外顯子設(shè)計(jì)了一對靶點(diǎn)。先要分別構(gòu)建出識別左、右半位點(diǎn)的 TAL

10、E重復(fù)序列載體，再與 pCS2 載體連接，形成最終的表達(dá)載體。將 TALE基本單元模塊載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 TOP 菌種中;大量搖活含有質(zhì)粒的大腸桿菌后，采用天根的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒;將質(zhì)粒經(jīng)酶切后( SpeI、Nhe I、Hind III)進(jìn)行回收、轉(zhuǎn)化、連接反應(yīng)，通過菌液 PC 篩選出連接成功的質(zhì)粒后，進(jìn)入下一輪反應(yīng);經(jīng)過幾輪酶切、切膠回收及連接反應(yīng)，直至完成所需要的兩側(cè)半位點(diǎn)的 TALE 重復(fù)序列，其中每輪的連接后都需要進(jìn)行測序確認(rèn);再將 TALE 重復(fù)序列與 pCS2 載體連接，構(gòu)建出最終的 pCS2-TALEN 表達(dá)載體質(zhì)粒，酶切檢測片段連接情況后，采用 SP6 測序確認(rèn)。6

11、、GeneA的miRNA載體表達(dá)構(gòu)建從 GenBank數(shù)據(jù)庫上搜索獲得 GeneA基因的mRNA序列。從 網(wǎng)站 www/mai獲取工具用來設(shè)計(jì) miRNA。選擇 GeneA基 因 mRNA序列中21nt片段為合適miRNA靶序列。結(jié)合線性化pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR真核表達(dá)載體(Invitrogen公司)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)4個(gè)64nt的pre-miRNA寡核苷酸序列，該序列針對 GeneA基因不同區(qū)域，并且得到寡核苷酸序列互補(bǔ)的序列，經(jīng)NCBI Blast的相似性搜索，排除其非特異同源性部分。其結(jié)構(gòu)為 5-TGC TG overhang + G + antisense target sequence+ miRNA loop + S