一測多評法測定丹參藥材中4種丹參酮類成分的含量-中草藥

一測多評法測定丹參藥材中4種丹參酮類成分的含量藍天鳳[收稿日期][基金項目]國家自然科學基金項目(20872083)；山東省科技攻關項目（2009GG2001021-16）；中國中醫(yī)科學院中藥研究所科研基金項目(ZZ20090107)[通訊作者[收稿日期][基金項目]國家自然科學基金項目(20872083)；山東省科技攻關項目（2009GG2001021-16）；中國中醫(yī)科學院中藥研究所科研基金項目(ZZ20090107)[通訊作者]于宗淵，研究員，碩士生導師，TelE-mail:yuzys@(1.山東中醫(yī)藥大學，濟南，250355；2.山東省分析測試中心濟南，250014；3.山東省中醫(yī)藥研究院，濟南，250014)[摘要]目的：建立測定丹參藥材中4種丹參酮類成分含量的一測多評法。方法：采用HPLC法，以丹參酮ⅡA為對照品，用外標法測定其在丹參藥材中的含量，同時測定丹參酮ⅡA與丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮的相對校正因子，用獲得的相對校正因子計算后3種成分的含量，實現一測多評；用外標法測定丹參藥材中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮的含量，比較其與采用相對校正因子計算值之間的差異。結果：各相對校正因子重現性良好；各成分采用相對校正因子計算的含量值與外標法測定值之間無顯著性差異。結論：一測多評法的適用性和可行性在丹參藥材4種丹參酮類成分的含量測定中得到驗證。[關鍵詞]丹參；丹參酮；一測多評法；校正因子QuantitativeanalysisoffourtanshinonesinrootandrhizomeofSalviamiltiorrhizawithonemarkerLANTianfeng1,WANGXiao2,WANGDaijie2,WANGLiang3,LIUQing3,YUZongyuan3*(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan,250355;2.ShandongAnalysisandTestCenter,Jinan,250014;3.ShandongAcademyofChineseMedicine,Jinan,250014)[Abstract]Objective:Todevelopamethodforsimultaneousdeterminationof4tanshinonesinrootandrhizomeofSalviamiltiorrhizabymeansofquantitativeanalysisofmulti-componentswithsinglemarker(QAMS).Method:TanshinoneⅡAwasselectedasthemarker.Therelativecorrectionfactors(RCF)oftanshinoneI,cryptotanshinoneanddihydrotanshinonetothemarkerwerecalculatedbyHPLC.Thecontentsofthe4tanshinonesin10samplesofrootandrhizomeofSalviamiltiorrhizaweredeterminedbybothexternalstandardmethodandtheQAMSmethod.ThevalidityoftheQAMSmethodwasevaluatedbycomparisonofthetwoquantitativeresults.Result:TheRCFhadgoodreproducibility.Nosignificantdifferencesbetweenthequantitativeresultsobtainedbythetwomethodswereobserved.Conclusion:ThepracticabilityofQAMSmethodhasbeenverifiedinthequantitativeanalysisof4tanshinonesinrootandrhizomeofSalviamiltiorrhiza.[Keywords]rootandrhizomeofSalviamiltiorrhiza;tanshinone;quantitativeanalysisofmulti-componentswithsinglemarker;relativecorrectionfactor如何有效地評價中藥質量是中藥現代研究面臨的關鍵問題之一。中藥成分復雜，現行的用1～2種化學成分評價中藥質量的模式，無法表征中藥化學成分的整體性和復雜性，不能有效地評價中藥的質量[1]。因此，應逐步建立采用多指標成分評價中藥質量的新模式。但由于采用多指標成分評價中藥質量需要有足夠數量的化學對照品，致使其在實際應用中受到限制。針對這一矛盾，王智民等提出了中藥質量評價“一測多評”的新思路[2]，即只采用1個對照品（供應充足、容易獲得者），來實現對多個成分(對照品不能充足供應者)的同步測定，并已成功運用于人參、三七、黃芩、吳茱萸等藥材中多種成分的含量測定[3-5]。丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖，是臨床常用大宗中藥材之一。丹參藥材因品種、產地、采收期等的不同，致使其所含主要成分差異較大[6]，因此應嚴格控制丹參藥材的質量。目前已有以多個丹參酮類成分的同步測定來評價丹參質量的相關報道[7]，但這種方法目前還難以推廣應用，主要是由于丹參中這類成分的對照品供應不足。筆者受“一測多評”思路的啟發(fā)，采用HPLC法，建立了以丹參酮ⅡA為對照品，同步測定丹參藥材中丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮4種成分含量的一測多評法。現將方法和結果報道如下：1儀器與試藥Agilent1200系列高效液相色譜系統，Waters600-996高效液相色譜系統，色譜柱Shim-packPREP-ODS(H)KITC18(4.6mm×250mm,5μm),WelchMaterialC18(4.6mm×250mm,5μm),AmethystC18-P(4.6mm×250mm,5丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮對照品均為自制，經HPLC面積歸一化法測定，純度均大于98%。乙腈為色譜純（山東禹王實業(yè)有限公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。10批丹參藥材樣品分別購自濟南市中魯醫(yī)院、中山大藥房、一笑堂大藥房、泉城大藥房、金日大藥房、澤生大藥房、魯醫(yī)南苑大藥房、漱玉平民大藥房、齊魯大藥房和神農本草大藥房。經山東省中醫(yī)藥研究院于宗淵研究員鑒定均為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖。2方法與結果2.1色譜條件色譜柱Shim-packPREP-ODS(H)KITC18（4.6mm×250mm,5μm)，流動相乙腈-0.2%乙酸（55∶45），流速1.0mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長270nm。在該色譜條件下，各待測成分分離度良好，AAB123412341.二氫丹參酮；2.隱丹參酮；3.丹參酮Ⅰ；4.丹參酮ⅡA圖1混合對照品（A）和丹參藥材樣品（B）HPLC圖2.2對照品溶液的制備分別取丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成含丹參酮ⅡA0.03mg·mL-1、丹參酮Ⅰ0.04mg·mL-1、隱丹參酮0.03mg·mL-1、二氫丹參酮0.005mg·mL-1的混合對照品溶液，置棕色瓶內，避光保存。2.3供試品溶液的制備取丹參藥材粉末（過60目篩）約0.3g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，2.4線性范圍考察取2.2項下制備的混合對照品溶液，準確稀釋1、4、8、12、16、20倍，配制成系列濃度的混合對照品溶液，每個濃度分別進樣10μL，以各對照品的進樣量對峰面積積分值進行回歸處理，得丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮的回歸方程及相關系數r，結果表明，各對照品的進樣量與峰面積積分值均呈良好的線性關系，見表1。表1線性范圍考察結果成分回歸方程r線性范圍μg丹參酮ⅡAY=1457.2C0.99950.015-0.30丹參酮ⅠY=1348.1C+3.61640.99970.020-0.40隱丹參酮Y=1575.1C-9.66650.99900.015-0.30二氫丹參酮Y=254.63C+0.75280.99920.0025-0.0502.5色譜系統精密度試驗取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10μL。計算丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮峰面積的RSD依次為0.31%、0.43%、0.68%、0.38%。2.6供試品溶液穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別于室溫避光放置0、4、8、12，16、20、24h時進樣，計算丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮峰面積的RSD依次為0.40%、0.30%、1.1%、1.4%，表明供試品溶液于室溫避光放置24h內穩(wěn)定。2.7方法重復性試驗取丹參藥材(濟南中山大藥房)粉末(過60目篩)6份，每份約0.3g，精密稱定，按2.3項下的方法制備各供試品溶液，測得其中丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮含量的平均值依次為3.15mg·g-1、1.68mg·g-1、1.13mg·g-1、0.297mg·g-1，RSD依次為1.3%、1.2%、1.6%、1.1%。2.8加樣回收試驗取2.7項下的丹參藥材粉末6份，每份約0.15g，精密稱定，按各成分在藥材中的含量分別加入計算量的對照品，按2.3項下的方法制備各供試品溶液，測定其中各成分的含量，分別計算加樣回收率。結果丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮的平均回收率依次為99.5%、96.8%、98.7%、99.6%。RSD依次為1.6%、1.3%、0.90%、2.9相對校正因子重現性考察取2.4項下配制的系列濃度的混合對照品溶液，每個濃度分別進樣10μL。以丹參酮ⅡA為內標，分別計算丹參酮ⅡA對丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮的相對校正因子，取平均值。分別考察了Waters600-996和Agilent1200系列兩種高效液相色譜系統和Shim-packPREP-ODS(H)KITC18(4.6mm×250mm,5μm),WelchMaterialC18(4.6mm×250mm,5μm),AmethystC18-P(4.6mm×250mm,5μm)3種色譜柱測得的各相對校正因子的重現性，結果表明，不同儀器及不同色譜柱所測得的各成分的相對校正因子無表2相對校正因子重現性考察結果(n=6)儀器色譜柱相對校正因子Waters600Shim-packPREP-ODS(H)KITC180.7330.8270.636WelchMaterialC180.7540.8230.613AmethystC18-P0.7530.8200.633Agilent1200Shim-packPREP-ODS(H)KITC180.7470.8250.634WelchMaterialC180.7500.8340.634AmethystC18-P0.7520.8210.638平均值0.7480.8250.631RSD1.0%0.63%1.4%2.10待測成分色譜峰定位參數考察為了在僅采用丹參酮ⅡA為對照品時，能夠確認丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮色譜峰的位置，從而通過獲得的相對校正因子同時計算后3種成分的含量，達到一測多評的目的，分別考察了采用不同儀器系統和不同色譜柱時其他待測成分色譜峰與丹參酮ⅡA色譜峰間的保留時間差和相對保留時間兩個參數。結果表明，其他待測成分與丹參酮ⅡA保留時間差的RSD在1.7%～2.0%，相對保留時間的RSD在0.61%～1.7%，見表3、表4。可見，與丹參酮ⅡA色譜峰間的保留時間差和相對保留時間均可作為其他3個待測成分色譜峰的定位參數，相對保留時間較保留時間差的變異更小。表3保留時間差考察結果儀器色譜柱保留時間差Waters600Shim-packPREP-ODS(H)KITC1823.0724.7635.39WelchMaterialC1822.6923.9634.43AmethystC18-P22.9924.8835.53Agilent1200Shim-packPREP-ODS(H)KITC1822.2624.5334.65WelchMaterialC1821.9423.8633.96AmethystC18-P22.2424.4734.94平均值22.5424.4934.82RSD2.0%1.8%1.7%表4相對保留時間考察結果儀器色譜柱相對保留時間Waters600Shim-packPREP-ODS(H)KITC180.5470.5140.305WelchMaterialC180.5490.5240.314AmethystC18-P0.5490.5120.303Agilent1200Shim-packPREP-ODS(H)KITC180.5520.5060.303WelchMaterialC180.5550.5040.311AmethystC18-P0.5550.5160.301平均值0.5510.5130.306RSD0.61%1.4%1.7%2.11樣品測定結果對10批丹參藥材中4種丹參酮類成分進行了測定，分別采用一測多評法和外標法計算其中丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮的含量，見表5。數據表明，兩種方法所得結果無顯著性差異。表5樣品測定結果（mg.g-1）樣品編號樣品來源丹參酮IIA丹參酮I隱丹參酮二氫丹參酮bababab1中魯醫(yī)院1.690.7510.7500.5900.5920.2190.2202中山大藥房3.101.641.651.081.120.2970.2993一笑堂大藥房2.711.381.390.6800.6770.2180.2194泉城大藥房1.910.8890.8910.6310.6300.3080.3105金日大藥房1.840.9760.9800.6790.6750.2740.2766澤生大藥房3.832.052.071.591.520.3600.3627魯醫(yī)南苑大藥房1.570.7810.7810.5080.5150.2330.2348漱玉平民大藥房1.640.6560.6540.4170.4310.1730.1739齊魯大藥房3.262.042.051.291.240.3460.34810神農本草大藥房1.690.5730.5700.5800.5780.1530.153注:a一測多評法計算結果；b外標法測定結果。3討論本文采用HPLC法，以丹參酮ⅡA為對照品，用外標法測定了其在丹參藥材中的含量，同時測定丹參酮ⅡA與丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮的相對校正因子，然后用獲得的相對校正因子計算丹參酮Ⅰ、隱丹參