E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)

E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)

中山醫(yī)學(xué)院免疫教研室2019-04ERosetteFormingCellTestE玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn) 中山醫(yī)學(xué)院免疫教研室ERosette1

掌握E花環(huán)形成的原理熟悉E花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)的步驟及光鏡下E花環(huán)的形態(tài)熟悉磁珠分離的原理

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

2T細(xì)胞的表面分子是T細(xì)胞與其它細(xì)胞和分子間相互識別及作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。它們在T細(xì)胞活化、增殖和分化等過程中起重要作用。TCR-CD3復(fù)合物參與T細(xì)胞的抗原識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；CD2、CD28、CTLA-4、CD45、CD40L等膜蛋白參與T細(xì)胞活化及T細(xì)胞與其它細(xì)胞間相互作用。CD4/CD8分子輔助TCR識別結(jié)合抗原，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；根據(jù)CD4和CD8分子的表達(dá)將其分為CD4+T和CD8+T細(xì)胞。T細(xì)胞CD2CD3TCRCD8密度梯度離心法CD4T細(xì)胞表面分子T細(xì)胞的表面分子是T細(xì)胞與其它細(xì)胞和分子間相互識別及作用的物3依靠表面標(biāo)記的分離方法

流式細(xì)胞術(shù)分離法：利用各種熒光素標(biāo)記的表面標(biāo)記特異性抗體，使不同表面標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)合上不同的熒光素，借助熒光活化細(xì)胞分選儀將各種細(xì)胞分離開來。

*

依靠表面標(biāo)記的分離方法

*4

*

免疫磁珠分離法：將針對細(xì)胞某種表面標(biāo)記的特異性抗體包被在磁性微珠上，與磁珠交聯(lián)的抗體能夠特異性結(jié)合具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞，然后用強(qiáng)磁場可將具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞分離出來。磁珠(microbead)標(biāo)記細(xì)胞上的磁珠在掃描電鏡下也幾乎看不到*免疫磁珠分離法：將針對細(xì)胞某種表面標(biāo)記的特異性抗體包被5磁珠分離策略：一.陽性分選磁珠標(biāo)記目的細(xì)胞未標(biāo)記細(xì)胞先行流出移出磁場后收集目的細(xì)胞CD4+T細(xì)胞分離柱CD4-T細(xì)胞磁珠分離策略：一.陽性分選磁珠標(biāo)記目的細(xì)胞未標(biāo)記細(xì)胞先行流6磁珠標(biāo)記非目的細(xì)胞目的細(xì)胞先行流出二.陰性分選磁珠標(biāo)記非目的細(xì)胞目的細(xì)胞先行流出二.陰性分選7成熟的人T細(xì)胞表面表達(dá)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體（即CD2分子），能與SRBC結(jié)合形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，可在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。本法可用于分離外周血T細(xì)胞及檢測T細(xì)胞的數(shù)量和比例。E花環(huán)分離法原理*

TTBSRBCCD2成熟的人T細(xì)胞表面表達(dá)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體（即CD2分8實(shí)驗(yàn)材料1.肝素抗凝血2.Hank’s液3.淋巴細(xì)胞分離液4.綿羊紅細(xì)胞懸液 5.滅活小牛血清6.水平離心機(jī)、37℃溫箱、顯微鏡等實(shí)驗(yàn)材料1.肝素抗凝血9實(shí)驗(yàn)方案取外周血綿羊紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離顯微鏡下觀察+實(shí)驗(yàn)方案取外周血綿羊紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離顯微鏡下觀察+10實(shí)驗(yàn)步驟淋巴細(xì)胞的分離用Hank’s液配成106細(xì)胞/0.1ml實(shí)驗(yàn)步驟淋巴細(xì)胞的分離用Hank’s液配成106細(xì)胞/0.111加等量滅活小牛血清(0.1ml)取0.1ml

加入0.5％綿羊紅細(xì)胞0.2ml混勻，37℃溫箱放置5分鐘1000rpm離心5min加等量滅活小牛血清(0.1ml)取0.1ml 加入0.5％綿12加1小滴1％美藍(lán)，用毛細(xì)吸管輕輕混勻取1滴于玻片上，加上蓋玻片高倍鏡下觀察玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞置4℃冰箱5min30-45min加1小滴1％美藍(lán)，用毛細(xì)吸管輕輕混勻取1滴于玻片上，加上蓋玻13結(jié)果判斷凡能結(jié)合三個以上綿羊紅細(xì)胞者為玫瑰花形成陽性細(xì)胞。正常人的花環(huán)形成率50-70%，大致可以代表周圍血中T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果判斷凡能結(jié)合三個以上綿羊紅細(xì)胞者為玫瑰花形成陽性細(xì)胞。14左:（甲紫染色，800×）：可見2個被綿羊紅細(xì)胞包圍而形成玫瑰環(huán)的T淋巴細(xì)胞；右:（吖啶橙染色）：圖中可見3個染成橙黃色熒光的T淋巴細(xì)胞被綿羊紅細(xì)胞所包圍。

T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán)左:（甲紫染色，800×）：可見2個被綿羊紅細(xì)胞包圍而形成玫15T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán)掃描電鏡，6500×T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán)掃描電鏡，6500×16E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)17測定外周血中的T細(xì)胞數(shù)，觀察受檢者的細(xì)胞免疫功能及免疫增強(qiáng)劑的療效。觀察免疫抑制劑的效果，協(xié)助進(jìn)行惡性腫瘤療效的觀察及預(yù)后判斷等。臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用18注意事項(xiàng)1.實(shí)驗(yàn)血液新鮮分離:是為了保證淋巴細(xì)胞的活性,不影響E玫瑰花環(huán)形成率。2.綿羊紅細(xì)胞要新鮮,采用無菌脫纖維羊血。注意事項(xiàng)1.實(shí)驗(yàn)血液新鮮分離:是為了保證淋巴細(xì)胞的活19Thanks!Thanks!20E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)

中山醫(yī)學(xué)院免疫教研室2019-04ERosetteFormingCellTestE玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn) 中山醫(yī)學(xué)院免疫教研室ERosette21

掌握E花環(huán)形成的原理熟悉E花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)的步驟及光鏡下E花環(huán)的形態(tài)熟悉磁珠分離的原理

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

22T細(xì)胞的表面分子是T細(xì)胞與其它細(xì)胞和分子間相互識別及作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。它們在T細(xì)胞活化、增殖和分化等過程中起重要作用。TCR-CD3復(fù)合物參與T細(xì)胞的抗原識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；CD2、CD28、CTLA-4、CD45、CD40L等膜蛋白參與T細(xì)胞活化及T細(xì)胞與其它細(xì)胞間相互作用。CD4/CD8分子輔助TCR識別結(jié)合抗原，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；根據(jù)CD4和CD8分子的表達(dá)將其分為CD4+T和CD8+T細(xì)胞。T細(xì)胞CD2CD3TCRCD8密度梯度離心法CD4T細(xì)胞表面分子T細(xì)胞的表面分子是T細(xì)胞與其它細(xì)胞和分子間相互識別及作用的物23依靠表面標(biāo)記的分離方法

流式細(xì)胞術(shù)分離法：利用各種熒光素標(biāo)記的表面標(biāo)記特異性抗體，使不同表面標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)合上不同的熒光素，借助熒光活化細(xì)胞分選儀將各種細(xì)胞分離開來。

*

依靠表面標(biāo)記的分離方法

*24

*

免疫磁珠分離法：將針對細(xì)胞某種表面標(biāo)記的特異性抗體包被在磁性微珠上，與磁珠交聯(lián)的抗體能夠特異性結(jié)合具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞，然后用強(qiáng)磁場可將具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞分離出來。磁珠(microbead)標(biāo)記細(xì)胞上的磁珠在掃描電鏡下也幾乎看不到*免疫磁珠分離法：將針對細(xì)胞某種表面標(biāo)記的特異性抗體包被25磁珠分離策略：一.陽性分選磁珠標(biāo)記目的細(xì)胞未標(biāo)記細(xì)胞先行流出移出磁場后收集目的細(xì)胞CD4+T細(xì)胞分離柱CD4-T細(xì)胞磁珠分離策略：一.陽性分選磁珠標(biāo)記目的細(xì)胞未標(biāo)記細(xì)胞先行流26磁珠標(biāo)記非目的細(xì)胞目的細(xì)胞先行流出二.陰性分選磁珠標(biāo)記非目的細(xì)胞目的細(xì)胞先行流出二.陰性分選27成熟的人T細(xì)胞表面表達(dá)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體（即CD2分子），能與SRBC結(jié)合形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，可在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。本法可用于分離外周血T細(xì)胞及檢測T細(xì)胞的數(shù)量和比例。E花環(huán)分離法原理*

TTBSRBCCD2成熟的人T細(xì)胞表面表達(dá)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體（即CD2分28實(shí)驗(yàn)材料1.肝素抗凝血2.Hank’s液3.淋巴細(xì)胞分離液4.綿羊紅細(xì)胞懸液 5.滅活小牛血清6.水平離心機(jī)、37℃溫箱、顯微鏡等實(shí)驗(yàn)材料1.肝素抗凝血29實(shí)驗(yàn)方案取外周血綿羊紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離顯微鏡下觀察+實(shí)驗(yàn)方案取外周血綿羊紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離顯微鏡下觀察+30實(shí)驗(yàn)步驟淋巴細(xì)胞的分離用Hank’s液配成106細(xì)胞/0.1ml實(shí)驗(yàn)步驟淋巴細(xì)胞的分離用Hank’s液配成106細(xì)胞/0.131加等量滅活小牛血清(0.1ml)取0.1ml

加入0.5％綿羊紅細(xì)胞0.2ml混勻，37℃溫箱放置5分鐘1000rpm離心5min加等量滅活小牛血清(0.1ml)取0.1ml 加入0.5％綿32加1小滴1％美藍(lán)，用毛細(xì)吸管輕輕混勻取1滴于玻片上，加上蓋玻片高倍鏡下觀察玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞置4℃冰箱5min30-45min加1小滴1％美藍(lán)，用毛細(xì)吸管輕輕混勻取1滴于玻片上，加上蓋玻33結(jié)果判斷凡能結(jié)合三個以上綿羊紅細(xì)胞者為玫瑰花形成陽性細(xì)胞。正常人的花環(huán)形成率50-70%，大致可以代表周圍血中T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果判斷凡能結(jié)合三個以上綿羊紅細(xì)胞者為玫瑰花形成陽性細(xì)胞。34左:（甲紫染色，800×）：可見2個被綿羊紅細(xì)胞包圍而形成玫瑰環(huán)的T淋巴細(xì)胞；右:（吖啶橙染色）：圖中可見3個染成橙黃色熒光的T淋巴細(xì)胞被綿羊紅細(xì)胞所包圍。

T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán)左:（甲紫染色，800×）：可見2個被綿羊紅細(xì)胞包圍而形成玫35T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán)掃描電鏡，6500×T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán)掃描電鏡，6500×36E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)37測定外周血中的T