分支桿菌屬細菌檢驗課件

微生物檢驗技術(shù)第八章分枝桿菌屬細菌檢驗劉垣目錄第一節(jié)、結(jié)核分枝桿菌第二節(jié)、麻風分枝桿菌第三節(jié)、非典型分枝桿菌

分枝桿菌屬是一類細長略彎曲的，有分枝生長趨勢的桿菌。本屬細菌的主要特點是細胞壁含有大量脂質(zhì)，因此不易著色，若經(jīng)加熱或延長染色時間而著色后能抵抗3%（強脫色劑)鹽酸乙醇的脫色，故又稱抗酸桿菌。分枝桿菌屬共性第一節(jié)、結(jié)核分枝桿菌核分枝桿菌簡稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌。對人致病的主要有人型、牛型和非洲型分支桿菌。其中人型結(jié)合分支桿菌的發(fā)病率最高。結(jié)核分枝桿菌經(jīng)多途徑感染，侵入全身多個器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進入機體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官感染，其中以肺結(jié)核最常見三大傳染疾病全球三大傳染疾全球疾全球三大傳染疾病愛滋?。ˋIDS）結(jié)核病（TB）瘧疾（Malaria）結(jié)核病近年來發(fā)病成上升趨勢，已成為危脅人類健康的嚴重的全球性重大公共衛(wèi)生問題結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病率最高，約占90%案例

患者，女，19歲。就診時主訴：近一個多月來咳嗽，痰中帶有血絲，無胸痛，但又明顯乏力，消瘦，食欲不振，自覺午后微熱，盜汗。查體：體溫38.2℃，慢性病容。實驗室檢查：白細胞8x109/L，血沉70mm/h。X射線透視：右肺尖有多發(fā)性小斑片狀陰影，邊緣模糊。去清晨咳痰進行抗酸染色，鏡下可見紅色略長微彎的桿菌。請問：1.患者可能患何種疾??？引起本病的病原體是什么？2.應(yīng)做哪些微生物學(xué)檢查已確診？知識鏈接結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。據(jù)WHO報道，每年約有800萬-1000萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病。我國建國前死亡率達200-300人/10萬，居各種疾病死亡原因之首，建國后人民生活水平提高，衛(wèi)生狀態(tài)改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率大為降低。但應(yīng)注意，世界上有些地區(qū)因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應(yīng)用、酗酒和貧困等原因，發(fā)病率又有上升趨勢。2.培養(yǎng)特性饞:專性需氧,營養(yǎng)要求高（L-J培養(yǎng)基）懶:生長溫度35℃,生長緩慢,18小時繁殖一代丑:液體培養(yǎng)基呈粗糙皺紋狀菌膜生長,固體培養(yǎng)基上形成形似菜花樣典型菌落“三耐三不耐”對某些理化因子的抵抗力較強：耐干燥耐酸堿耐染料濕熱紫外線酒精4.抵抗力不耐受脂質(zhì)：磷脂

索狀因子

蠟質(zhì)D硫酸腦苷酯

蛋白質(zhì)莢膜1、致病物質(zhì)尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生內(nèi)外毒素及侵襲性酶，主要由菌體成分導(dǎo)致的炎癥和免疫損傷引起病變主要致病物質(zhì)二、臨床意義2.所致疾病2、所致疾病※結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進入機體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官感染，其中以肺結(jié)核最常見?！Y(jié)核分支桿菌可經(jīng)淋巴-血液播散，引起腦結(jié)核、腎結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎等3.免疫性抗體無保護作用，臨床輔助診斷有意義。細胞免疫發(fā)揮重要抗感染作用TB菌的感染率很高，發(fā)病率卻較低?？菇Y(jié)核的免疫稱為有菌免疫，菌體及其成分消失，免疫力也隨之消失4、結(jié)核菌素試驗結(jié)核菌素即結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)，目前常用結(jié)核菌素制劑是純蛋白衍生物（PPD）1）原理：結(jié)核菌素試驗是應(yīng)用結(jié)核菌素進行皮膚試驗來測定機體對結(jié)核分枝桿菌是否能引起超敏反應(yīng)的一種試驗2）試驗方法與意義：受試者前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射PPD5U，48～72h后，觀察結(jié)果。3）結(jié)果及意義：紅腫硬結(jié)超過5mm者為陽性，≥15mm為強陽性，對臨床診斷有意義。若PPD-C側(cè)紅腫大于BCG-PPD側(cè)為感染。反之，BCG-PPD側(cè)大于PPD-C側(cè)，可能系卡介苗接種所致。4）用途：①選擇卡介苗的接種對象和測定接種效果；②輔助診斷嬰幼兒結(jié)核病；③在流行病學(xué)中，作為調(diào)查人群感染結(jié)核桿菌的一個指標；④測定腫瘤患者的細胞免疫功能。三、微生物檢查1、標本采集：根據(jù)病變部位不同采集不同的標本。常見標本為痰、尿、胸腹水等。1）痰：留取清晨第一口痰3-5ml。合格的痰標本應(yīng)使患者深吸氣后，由肺部深處一干咳痰、血痰或黏液痰為合格標本。用WHO推薦的國際通用螺旋蓋痰瓶，或用密封塑料盒、蠟紙盒收集后送檢。2）其他：無菌抽取腦脊液、胸水、腹水及關(guān)節(jié)液等盛無菌試管送檢。腦脊液標本靜置后，表面可有細薄凝塊，取凝塊作涂片或接種培養(yǎng)臨床標本

涂片檢查

分離培養(yǎng)

HPLC分子鑒定免疫學(xué)鑒定直接涂片集菌涂片處理標本或無污染標本染色液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基動物試驗

（L-J培養(yǎng)基）抗酸..金胺O..

35℃涂片鏡檢儀器培養(yǎng)

＜7天生長＞7天生長快速生長菌慢生長菌初步鑒定

抗酸染色菌落特點鑒定試驗藥敏試驗2、檢驗程序結(jié)核分枝桿菌痰涂片抗酸染色（×1000）（3）分離培養(yǎng)1）培養(yǎng)基選擇：通常使用的固體培養(yǎng)基有改良羅氏（L-J）培養(yǎng)基、小川培養(yǎng)基、米氏7H10和7H11，液體培養(yǎng)基有米氏7H9和蘇通氏培養(yǎng)基。2）標本的前處理：前處理的目的：一是殺死雜菌，二是液化標本。常見的方法：①40g/LNaOH法：1份痰+2份40g/LNaOH溶液，35℃水浴消化15-30分鐘，震蕩2-3次，3000r/min離心15min，棄上清，沉淀物接種②4%H2SO4法：多用于尿標本的前處理，1份標本+2-4倍4%H2SO4，室溫20min，震蕩2-3次，3000r/min離心15min，棄上清，沉淀物接種③胰酶-苯扎溴銨法抗酸染色（×1000）結(jié)果報告

－0／300視野

±

1～2條／300視野＋1～9條/100視野

2＋1～9條/10視野

3＋1～9條/每個視野

4＋>9/每個視野第二節(jié)、麻風分枝桿菌麻風分枝桿菌是麻風病的病原菌。麻風是一種慢性傳染病。主要表現(xiàn)為皮膚、粘膜和神經(jīng)末梢的損害。晚期可侵犯深部組織和器官，形成肉芽腫1、形態(tài)與染色較結(jié)核桿菌粗而短，抗酸染色陽性，呈束狀或團狀排列，革蘭陽性，無鞭毛、莢膜和芽胞。典型細胞內(nèi)寄生菌，可形成麻風細胞（即有麻風桿菌存在、呈泡沫狀的細胞）2、培養(yǎng)特性：目前不能人工培養(yǎng)，可用動物犰狳（qiuyu）接種建立模型。一、生物學(xué)特性二、臨床意義傳染源：麻風患者傳播途徑：直接接觸、飛沫傳播易感人群：多為免疫缺陷個體3種臨床類型:1)瘤型麻風：傳染性強且病情嚴重，細胞免疫功能缺陷而體液免疫正常。在皮膚和黏膜下形成結(jié)節(jié)性紅斑，稱為麻風結(jié)節(jié)。面部結(jié)節(jié)融合可呈“獅面”狀。2）結(jié)核樣型麻風3）界線類綜合征根據(jù)臨床表現(xiàn)、免疫病理變化和細菌檢查結(jié)果等將麻風分為瘤型、結(jié)核樣型、界線綜合征兩種病型結(jié)核樣型麻風患者手部病變體征第三節(jié)、非典型分支桿菌非典型分枝桿菌分為光產(chǎn)色菌（I群）、暗產(chǎn)色菌（II群）、不產(chǎn)色菌（III群）和速生菌（IV群）4群。廣泛分布在自然界，致病性較弱，可寄居與人體。當機體抵抗力低下時，可導(dǎo)致肺內(nèi)、外或淋巴結(jié)類似結(jié)核的病變。特點結(jié)核分枝桿菌非典型分支桿菌菌落特征粗糙、顆粒狀光滑或粗糙菌落顏色乳白色或米白色黃色或橘黃色耐熱觸酶試驗-+中性紅試驗+-索狀因子++/-豚鼠致病性+-本章小結(jié)

分枝桿菌屬的細菌因其細胞壁富含脂質(zhì)，經(jīng)加溫或延遲染色時間后能抵抗一定濃度鹽酸乙醇的脫色作用，故稱抗酸桿菌。該屬細菌培養(yǎng)時專性需氧，營養(yǎng)要求特殊，大多數(shù)生長緩慢，其中的麻風分枝桿菌目前尚不能人工培養(yǎng)。該屬細菌中臨床最常見的是結(jié)核分枝桿菌，該菌經(jīng)萋–尼抗酸染色后呈紅色，用熒光染料金胺O染色后，在熒光顯微鏡下菌體發(fā)出黃綠色熒光。結(jié)核分枝桿菌常用羅–琴培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，該菌在羅–琴培養(yǎng)基上生長緩慢，一般2～4周才能形成肉眼可見菌落，菌落外觀類似“菜花樣”；在液體培養(yǎng)基中生長較為迅速，一般1～2周即可生長，常形成表面菌膜，有毒力菌株可呈束狀生長結(jié)核分枝桿菌典型生化特征表現(xiàn)為煙酸累積試驗陽性、還原硝酸鹽為亞硝酸鹽、觸酶陽性。該菌不被T2H抑制、吡嗪酰胺酶陽性，而牛結(jié)核分枝桿菌正好相反。結(jié)核分枝桿菌易發(fā)生變異，卡介苗是其減毒活疫苗。該菌對理化因素有較強抵抗力，耐干燥、耐一定濃度酸堿和孔雀綠或結(jié)晶紫等染料，但對乙醇、紫外線、濕熱等敏感。該菌是結(jié)核病的病原體，可侵犯全身各個器官，但以肺結(jié)核最為多見。其致病物質(zhì)主要與其菌體成分如莢膜、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等有關(guān)，結(jié)核的免疫屬于有菌免疫，結(jié)核菌素試驗通過檢測機體對結(jié)核菌素有無遲發(fā)型超敏反應(yīng)，從而了解機體是否有過結(jié)核分枝桿菌感染，或?qū)Y(jié)核分枝桿菌是否具有免疫力

結(jié)核分枝桿菌的實驗室檢查主要包括臨床標本涂片抗酸染色后直接顯微鏡檢查和分離培養(yǎng)鑒定兩大類，