DB6111-T 172-2021 獼猴桃病毒鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020CCSB16

DB6111楊凌農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB6111/T172—2021獼猴桃病毒鑒定技術(shù)規(guī)程Technicalstandardforvirusidentificationinkiwifruitseedlings20212021102220211101楊凌示范區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB6111/T172—2021前??言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》起草。本文件由西北農(nóng)林科技大學(xué)提出。本文件由楊凌示范區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)、陜西省農(nóng)村科技開發(fā)中心。本文件起草人：趙磊、徐明、劉佩、吳云鋒、雷玉山。本文件由西北農(nóng)林科技大學(xué)和陜西省農(nóng)村科技開發(fā)中心負(fù)責(zé)解釋。聯(lián)系方式系地址：楊凌示范區(qū)邰城路3號(hào)IIDB6111/T172DB6111/T172—2021DB6111/T172—2021DB6111/T172—2021獼猴桃病毒鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了獼猴桃病毒鑒定技術(shù)的術(shù)語和定義、檢測對(duì)象、取樣部位、抽樣、鑒定方法和判定規(guī)則。本文件適用于楊凌示范區(qū)獼猴桃母本樹、獼猴桃苗木的病毒鑒定。環(huán)境相似的獼猴桃產(chǎn)區(qū)可參照?qǐng)?zhí)行。規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.13.1獼猴桃母本樹stockplantofkiwifruit提供獼猴桃種條或建外植體所需要幼嫩枝條的獼猴桃母株。3.2獼猴桃苗木Kiwifruitseedling經(jīng)扦插、嫁接、組培等方式繁育的獼猴桃種苗。3.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Reversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR）提取獼猴桃檢材的總RNA，以其中的mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。4檢測對(duì)象獼猴桃主要病毒：A（ActinidiavirusAAcVA）；B（ActinidiavirusB，AcVB）；C（ActinidiavirusC，AcVC）；獼猴桃褪綠環(huán)斑相關(guān)病毒（Actinidiachloroticringspot-associatedvirusAcCRaV）；1黃瓜花葉病毒（cucumbermosaicvirusCMV）；蘋果莖溝病毒（applestemgroovingvirusASGV）；X（potatovirusX,PVX）；柑橘葉斑駁病毒（citrusleafblotchvirus，CLBV）；1（Actinidiavirus1，AcV-1）；獼猴桃褪綠環(huán)斑病毒(ActinidiayellowingringspotvirusAYRSpV）；k1（Actinidiayellowingvirus1AcYV1）；2（Actinidiayellowingvirus2AcYV2）；獼猴桃種傳潛隱病毒（Actinidiaseed-bornelatentvirusASbLV)。抽樣猴桃母本樹每株均需檢測。出圃苗木采用51萬株以內(nèi)抽檢100（含1萬株萬株～10（含10萬株首個(gè)1萬株抽100株，之后每增加1萬株增檢50株，不足1萬株按1萬株計(jì)；超過10萬株，第1萬～10萬株按上述方法抽樣，之后每增加1萬株增檢20株，不足1萬株按1萬株計(jì)。5取樣部位5取樣部位24h或放置于-80節(jié)剪下枝條，撕開表皮用小刀刮取1g左右韌皮部組織，立即使用或放置于-80℃保存?zhèn)溆谩?鑒定方法雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（DAS-ELISA）詳見附錄A。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR）詳見附錄B。7判定規(guī)則酶聯(lián)免疫檢測或RT-PCR檢測呈陽性反應(yīng)的判定為攜帶病毒。脫毒母本樹帶毒率為0、出圃苗木帶毒率≤3.0%判定為合格苗木。2A.1.3洗滌緩沖液洗滌緩沖液的配制見表A.2。A.1.3洗滌緩沖液洗滌緩沖液的配制見表A.2。表A.2洗滌緩沖液的配制A.1.4包被緩沖液包被緩沖液的配制見表A.3。3附錄A（規(guī)范性附錄）雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測法（DAS-ELISA法）溶液配制所用化學(xué)試劑均為分析純級(jí)規(guī)格，用水為蒸餾水。抽提緩沖液抽提緩沖液的配制見表A.1。表A.1抽提緩沖液的配制藥品名稱質(zhì)量g三羥甲基氨基甲烷(Tris)60.50氯化鈉（NaCl）8.00聚乙烯吡咯烷酮（PVP）,MW4000020.00聚乙二醇（PEG）10.00吐溫-20（Tween-20）0.50溶于900mL蒸餾水中，用鹽酸將溶液pH值調(diào)整到8.2，再用蒸餾水定容至1000mL，4℃下保存，有效期1年。藥品名稱質(zhì)量g氯化鈉（NaCl）8.00磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.15磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.20氯化鉀（KCl）0.20吐溫-20（Tween-20）0.50： 溶于900mL蒸餾水中，用鹽酸將溶液pH值調(diào)整到7.4，再用蒸餾水定容至1000mL，41年。表A.3包被緩沖液的配制藥品名稱質(zhì)量g碳酸鈉（NaCO3）1.59碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93900mLpH9.61000mL，4℃下保存，有效期1酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液的配制見表A.4。表A.4酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液的配制藥品名稱質(zhì)量g牛血清蛋白（BSA）2.00聚乙烯吡咯烷酮（PVP）,MW4000020.00溶于900mL蒸餾水中，再用蒸餾水定容至1000mL，4℃下保存，有效期1年。底物緩沖液的配制見表A.5。表A.5底物緩沖液的配制A.1.7底物溶液底物緩沖液的配制見表A.5。表A.5底物緩沖液的配制A.1.7底物溶液秤取5mg4-硝基苯基磷酸二鈉鹽（PNP）溶解于5mL底物緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用。A.2操作步驟A.2.1樣品制備取待檢樣品0.4g，加入2mL抽提緩沖液，用研缽研磨至無可見顆粒的糊狀，410000rpm離心10min，取上清液備用。A.2.2包被抗體120μLh或44藥品名稱質(zhì)量/體積六水氯化鎂（MgCl2·6H2O）0.10g二乙醇胺（MDEA）97.00ml溶于900mL蒸餾水中，用鹽酸將溶液pH值調(diào)整到9.8，再用蒸餾水定容至1000mL，4℃下保存，有效期1年。洗板用洗滌緩沖液浸泡洗滌抗體孵育的酶標(biāo)板3次，每次3min～5min。包被樣品酶標(biāo)板每孔加110μL制備的樣品，372h或43洗板同A.2.3。包被酶標(biāo)抗體用酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液按照酶標(biāo)抗體說明書的稀釋倍數(shù)將其稀釋，每加樣孔加100μL經(jīng)過稀釋的酶標(biāo)抗體，37℃保濕孵育2h或4℃保濕過夜。洗板同A.2.3。酶標(biāo)板每孔加入90μL底物溶液，室溫避光反應(yīng)1h。A.4終止反應(yīng)酶標(biāo)板每孔加入3mol/L的NaOH溶液50μL終止反應(yīng)。酶標(biāo)板每孔加入90μL底物溶液，室溫避光反應(yīng)1h。A.4終止反應(yīng)酶標(biāo)板每孔加入3mol/L的NaOH溶液50μL終止反應(yīng)。A.5酶聯(lián)檢測405nm（OA.5.1判斷規(guī)則按照表A.6判定結(jié)果：表A.1結(jié)果判定法核驗(yàn)檢測確定5項(xiàng)目指標(biāo)判定（檢測樣品OD405-空白對(duì)照OD405）/（陰性對(duì)照OD405-空白對(duì)照OD405）≥2.0陽性1.5～2.0疑似陽性≤1.5陰性附錄B（規(guī)范性附錄）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR法）試劑盒植物RNA提取試劑盒：選擇適合提取含有多糖多酚材料的RNA試劑盒。反轉(zhuǎn)錄試劑盒：使用市售的商品反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明進(jìn)行操作。PCR擴(kuò)增試劑盒：使用市售的商品PCR擴(kuò)增試劑盒，按照說明進(jìn)行操作。引物病毒PCR檢測特異性引物見表B.1表B.1獼猴桃病毒的特異性引物病毒引物名稱引物序列5'-3'片段大小bpAcV-1AcV1-CPFTGAGCTRGGRATAGATGTTGC376AcV1-CPRTCTCTCAGGGTTMGGATGAGTAcYV1AcYV1-FCAACGCCGCAAACATCCTTAT624AcYV1-RCACCTGCTTCTCACAAACAGTCTCAAcYV2AcYV2-FAAAACAACTCAACAGAAACGCACTA530AcYV2-RTTCCCTGAAGTAGACAGAATAGACGAYRSpVAYRSpV-FTTTGGACTGGGAACGTAGAGG337AYRSpV-RCGAGAAAGTGAGGTTATCGGGAcVAAcVAFCATGGCAAAGAATATCTCAAG471AcVARAGATCCAACCCAGAGTTGAAAAcVBAcVB5FGTTTGCGAGGAGACGTAGGGC342AcVB5RAGTTAAGTGCTCTYGGRGGTGTGAcVCAcVCF6AAAGAACCCTACCTCCACC1106AcVCR6CCATCTATATCTCAACAGCCTGCTCGAcCRaVAcCRaV3FATCCAAGAATTCCTTAACAGCA477AcCRaV3RTGTGCAATCATGGCTTATCAGAASGVASGV-UCCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC499ASGV-2GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCCCMVCMVFGAGTCGTGCGTTTTCTTTGTGTTTT183CMVRAATGGCGAGGGTTTTATTGAGTCCLBVdCLBV-F2TATTGGCAGGAGCTGAGGCAG144dCLBV-R2CGGTCAGCGGTTGTTCATGCPVXPVXFAGTGCGCGAGGTTTACCAATC790PVXRGTGGTTTGCCGCGAACGATTCASbLVASbLV-FCAGATGTCTCAAGTTATGTCCGA848ASbLV-RTAGCAAGACATTGGCCTTATTAB.3操作步驟B.3操作步驟B.3.1獼猴桃RNA提取6提取方法按照試劑盒操作說明書提取。判定規(guī)則RNOD/O比值2.ng/μL以上的，以此為模板直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或置于-80逆轉(zhuǎn)錄按照試劑盒操作說明書提取。病毒檢測PCR擴(kuò)增PCR的反應(yīng)體系在PCR反應(yīng)管中依次加入12.5μL2×MIX1μLcDNA模板0.5μL、無菌蒸餾水10μL，PCR反應(yīng)體系為25μL。目標(biāo)病毒對(duì)應(yīng)檢測引物見表B.1。PCR反應(yīng)程序72℃5min，取出PCR反應(yīng)管，采用凝膠電泳法檢測反應(yīng)產(chǎn)物。電泳檢測制備1%的瓊脂糖凝膠，每個(gè)泳道加入10μL的PCR產(chǎn)物，100V恒壓電泳30min。72℃5min，取出PCR反應(yīng)管，采用凝膠電