腎臟缺血預適應對核因子κB活性及細胞凋亡的影響

腎臟缺血預適應對核因子-κB活性及細胞凋亡的影響【摘要】目的通過建立大鼠腎臟急性缺血/再灌注(I/R)及缺血預適應(I/P+I/R)模型，初步研究不同的缺血方式后腎臟核因子-κB〔NF-κB〕活性及二聚體亞單位的構成，討論其減輕腎臟腎小管細胞凋亡的機制。方法30只雄性SD大鼠摘除右腎、別離出左腎動脈后隨機均分為3組〔n=10〕：A組為假手術組〔Sha組〕，只別離左腎動脈，暴露術野60in后直接縫合，24h后取腎；B組為缺血/再灌注組(I/R組)，持續(xù)夾閉左腎動脈45in，恢復血供24h后取腎；組為缺血預適應+缺血/再灌注組(I/P+I/R組)，左腎動脈夾閉2in，松開5in，重復3個循環(huán)，余同I/R組。分別用生化學方法檢測血肌酐值的變化，組織病理學評價腎小管損傷程度評分，凝膠電泳遲滯分析檢測腎組織NF-κB/DNA結合活性，超遲滯分析檢測NF-κB亞單位的構成，Tunel法檢測腎小管上皮細胞的凋亡。結果血清學檢查及腎小管損傷評分提示，I/R組腎臟組織病理改變明顯，損傷程度重，與Sha組比擬，差異有統(tǒng)計學意義〔P0.05〕；與I/R組比擬，I/P+I/R組損傷程度那么明顯減輕，差異有統(tǒng)計學意義〔P0.05〕。凝膠電泳遲滯分析檢測腎組織NF-κB/DNA結合活性I/P+I/R組明顯高于Sha組，差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；超遲滯分析檢測NF-κB亞單位含有p65、p50；差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論腎臟缺血預適應可通過抑制NF-κB轉錄活性，減輕腎小管上皮細胞凋亡，從而發(fā)揮損傷保護效應。【關鍵詞】腎臟；缺血預適應；核因子-κB；細胞凋亡Abstrat:bjetiveTinvestigatetheeffetfdifferentdesfrenalisheiantheativityfNF-κBandthepsitinfdierisubunitandtexplretheausativeehanisunderlyingtheattenuatedapptsisfrenaltubularellsiththeestablishentfanialdelsfauterenalishei/reperfusin(I/R)andisheiprenditining(I/P+I/R)inrats.ethds30aleSprague-Daleyratsererandizedint3grups(n=10eah)fllingrightnephretyandislatinftheleftrenalartery.GrupAservedasthesha-peratedntrl,nlyithislatinftheleftrenalarteryandsuturefllingexpsurefr60in.GrupB(I/Rgrup)ratseresubjetedtisheiafr45inbylapingftheleftrenalarteryandsubsequentresuedbldsupply.Grup(I/P+I/R)ratserepre-treatedith3ylesf2-inuteisheiaand5-inutereperfusin.Alltheratseresarifiedat24handnephretyasperfredfranalysis,inludingbiheialdeterinatinftheserureatinine,histpathlgialevaluatinftherenaltubules,eletrphretibilityshiftassay(ESA)frenalNF-кB/DNAbindingativity,supershiftassayfthepsitinfNF-κBplexesinrenaltissuesandterinaldexynuletidyltransferasedUTPnikendlabeling(TUNEL)assayftheapptsisfrenaltubularepithelialells.ResultsSerlgialexainatinsandsresfrenaltubularinjuryrevealedevidenthistpatlgialhangesandseriusinjuryinrenaltissuesingrupB.parediththeshagrup,thediffereneserestatistiallysignifiant(P0.05);paredithgrupB,gruphadarkedlyattenuatedinjuryithsignifiantstatistialdifferenes(P0.05);ESAresultsshedthattherenalNF-кB/DNAbindingativityassignifiantlyhigheringrupthaningrupA,ithsignifiantstatistialdifferenes(P0.05);andsupershiftassayfthepsitinfNF-κBdierisubunitnfiredthepresenefp65andp50ingrup,ithsignifiantstatistialdifferenes(P0.05).nlusinRenalisheiprenditiningattenuatestheapptsisfrenaltubularepithelialellsviatheinhibitinfthetransriptinalativityfNF-кB,andthushastheprtetiveeffetnrenaltissues.Keyrds:kidney;isheiprenditining;nulearfatr-кB;apptsis缺血預適應〔isheiprenditining，IP〕是指臟器短暫缺血/再灌注〔isheia/reperfusin,I/R〕后能耐受更長時間的缺血，其內在的分子生物學機制尚未明了［1］。我們的前期研究說明，大鼠腎臟也存在缺血預適應的現象，具有一定的腎臟保護作用［2］。已有研究發(fā)現，細胞凋亡可能是缺血/再灌損傷的重要環(huán)節(jié)之一，而核因子-κB〔NF-κB〕是調控細胞凋亡的關鍵轉錄因子，可調控多種抗凋亡和促凋亡基因的轉錄［3］。但對于腎臟缺血預適應的抗凋亡作用及胞內NF-κB信號轉導通路的活化特點尚未說明。為此，本實驗通過觀察腎臟缺血預適應對NF-κB轉錄活性及細胞凋亡的影響，討論腎臟缺血預適應的抗凋亡機制，為腎臟缺血/再灌注損傷的防治提供重要的理論根據。1材料和方法1.1實驗動物選擇與分組安康雄性SD大鼠30只，體重240～250g，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供。3%戊巴比妥鈉麻醉后，所有動物均摘除右腎,穩(wěn)定10in；隨機分成3組：A組為假手術組(Sha組，n=10)，只別離左腎動脈，暴露術野60in后直接縫合，24h后取材;B組為缺血/再灌注組(I/R組，n=10)持續(xù)夾閉左腎動脈45in，恢復血供24h后取材；組為缺血預適應+缺血/再灌注組(I/P+I/R組，n=10)，左腎動脈夾閉2in，松開5in,重復3個循環(huán)，余同I/R組。1.2血清學檢查大鼠腔靜脈采血1l,立即用離心機3000r/in離心5in,取上清液進展血肌酐值測定。1.3組織學檢查1.4凝膠電泳遲滯分析(ESA)測定NF-κB/DNA結合活性提取腎組織核蛋白，以微量考馬斯亮藍法測定核蛋白濃度，調至2g/L，并于-70℃保存。按試劑盒(Prega公司)說明進展：在T4激酶作用下，將γ-32P-ATP(北京亞輝公司)標記到NF-κB位點DN(探針)上后純化。將核蛋白抽提物與標記的NF-κB探針反響，同時做特異性競爭結合試驗。超遲滯分析〔supershiftassay〕局部：將2μl抗NF-κB亞單位抗體p65、p50、Rel-B、p52分別在參加探針前參加反響體系，室溫孵育30in，反響產物經4%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳完畢后，-70℃放射性自顯影，X線膠片上的滯后帶用凝膠成像分析系統(tǒng)進展分析。以相對密度單位(RDU)表示NF-κB/DNA結合活性。1.5原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記法(TUNEL)測定腎小管上皮細胞凋亡試劑盒由南京凱基生物公司提供。切片厚5μ,常規(guī)脫蠟入水，經3％過氧化氫室溫處理10in以消除內源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗3次，蛋白酶K消化30in，然后用PBS緩沖液沖洗3次，參加TUNEL的反響液37℃孵育60in，用PBS緩沖液沖洗3次后加親和素辣根過氧化物酶，37℃濕盒孵育30in，PBS緩沖液沖洗3次，加DAB試劑顯色，蘇木精染色，脫水、透明、封片。光鏡下觀察凋亡細胞，細胞核呈棕黃色者為陽性細胞，于凋亡細胞分布區(qū)域，隨機選取5個視野，用400倍光鏡計數凋亡細胞，以腎小管上皮細胞凋亡陽性細胞數占總腎小管上皮細胞數的百分比作為腎小管上皮細胞凋亡指數(AI)。1.6統(tǒng)計學處理所有數據均以±s表示，各組間檢驗用方差分析(F檢驗和q檢驗)。所有數據使用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進展分析。P0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。2結果2.1各組大鼠血肌酐的變化I/R組和I/P+I/R組大鼠血肌酐值與Sha組比擬都有明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義〔P0.01〕，但是I/P+I/R組血肌酐值明顯低于I/R組，差異具有統(tǒng)計學意義〔P0.05〕。見表1。表1各組大鼠血肌酐、腎小管損傷積分及AI的比擬〔略〕2.2各組大鼠腎小管損傷積分的變化I/R組腎臟組織病理改變明顯，受損最嚴重的部位是皮髓交界處、外髓內帶的近端小管，主要表現為小管上皮細胞脫落、刷狀緣消失和腎小管阻塞。與I/R組比擬，I/P+I/R組損傷程度那么明顯減輕，腎小管損傷積清楚顯減少〔P0.05〕見圖1、表1。2.3各組大鼠腎組織NF-κB/DNA結合活性的變化檢測結果說明實驗組的NF-κB/DNA結合活性明顯高于Sha組〔2.24±0.15vs.0.69±0.22，1.25±0.20vs.0.69±0.22),差異具有統(tǒng)計學意義〔P0.01〕。I/R+I/P組的NF-κB/DNA結合活性較I/R組明顯減少(1.25±0.20vs.2.24±0.15)，差異具有統(tǒng)計學意義〔P0.05〕。見圖2。這說明腎臟缺血預適應可以抑制I/P+I/R組NF-κB/DNA結合活性。轉貼于論文聯盟.ll.2.4凝膠電泳超遲滯分析檢測I/P+I/R組NF-κB二聚體的構成檢測結果說明I/P+I/R組NF-κB二聚體亞基含有p65和p50，不含有p52和Rel-B，見圖3。這提示腎臟缺血預適應激活了NF-κB經典途徑，可能不通過非經典途徑而發(fā)揮保護作用。2.5各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況的比擬Sha組偶見凋亡的細胞，見圖4B；I/R組和I/P+I/R組凋亡的細胞數明顯增減加，見圖4、D；與Sha組比擬，再灌注24h后，I/R組和I/P+I/R組凋亡的細胞數明顯增減加，差異具有統(tǒng)計學意義〔P0.01〕,見表1；與I/R組比擬，I/P+I/R組凋亡的細胞數減少，差異具有統(tǒng)計學意義〔P0.05〕,見表1。3討論缺血/再灌注損傷是指缺血期處于可逆損傷的細胞經恢復血液供給后轉化為不可逆損傷,凋亡越來越被認為是缺血/再灌注時細胞死亡的重要機制之一。而缺血/再灌注損傷造成細胞凋亡的機制的非常復雜。近年來，隨著分子生物學的進展，越來越多的證據說明NF-κB在細胞凋亡中的關鍵作用，早期活化的NF-κB通過促進凋亡抑制基因的轉錄，抑制促凋亡基因表達，可以保護組織細胞免于凋亡，而后期活化那么使細胞凋亡加重［3,5-7］。我們在先前的實驗中證實了大鼠腎臟存在缺血預適應的現象，同腎臟直接、持續(xù)性缺血相比，預缺血活化的NF-κB頂峰提早，可以保護腎臟免受隨后持續(xù)性缺血所引起的損傷作用。當應用NF-κB特異性抑制劑處理以后，該保護作用消失［2,8］。因此本研究采用夾閉左腎動脈，缺血2in/再灌注5in重復3次的方法來誘導缺血預適應，可以使NF-κB早期活化，從而發(fā)揮腎臟保護作用。以往的傳統(tǒng)觀點認為NF-κB的活化主要是促進炎癥因子的釋放；隨著研究的深化，發(fā)現NF-κB的作用具有兩面性。在炎癥的不同階段，NF-κB的作用不同甚至相反；可能與其活化的方式、二聚體的組成從而調控不同的基因有關［9-10］。本研究結果說明：同腎臟直接、持續(xù)性缺血相比，缺血預適應可以明顯抑制NF-κB的活性，從而減輕了預處理組的腎小管上皮細胞的凋亡。雖然I/R組和I/P+I/R組都激活了NF-κB的活性，但兩組大鼠不同的預后提示:NF-κB可能是處于細胞生存與凋亡的調節(jié)點，由于NF-κB的靶基因上存在眾多功能性的κB結合位點，推測可能與下調促凋亡因子的基因表達，或者通過上調抗凋亡基因的表達而發(fā)揮抗凋亡作用有關。至于詳細誘導那些基因，那么有待于進一步研究。目前主要存在兩條NF-κB激活途徑：一條是經典途徑，與先天性免疫有關，在該途徑中此時活化的NF-κB二聚體以p65/p50為主［11-12］；另外一條為可替代途徑，其活化的NF-κB二聚體以Rel-B/p52為主，主要與適應性免疫功能有關［13］。本研究發(fā)現缺血預適應組激活的NF-κB亞單位含有p65、p50，提示缺血預適應組激活了經典途徑。本實驗尚未發(fā)現可替代途徑的激活，推測是由于本次研究的動物模型是腎臟急性缺血/再灌注損傷模型，而可替代途徑的激活需要較長時間，其主要作用是參與淋巴器官發(fā)育和B細胞成熟以及促進骨骼和皮膚的分化發(fā)育。綜合上述，腎臟缺血預適應可減輕缺血/再灌注損傷，其機制與抑制NF-κB活性和減輕腎小管上皮細胞凋亡有關?！緟⒖嘉墨I】［1］urryE,JenningsRB,REierKA.Prenditiningithisheia:adelayflethalellinjuryinisheiyardiu［J］.irulatin,1986,74(5):1124-1136.［2］李鵬，曹長春.腎臟缺血預適應與IA-1的作用［J］.中華腎臟病雜志,2022,20(3):199-201［3］Barkett,GilreTD.ntrlfapptsisbyRel/NF-κBtransriptinfatrs［J］.ngene,1999,18(49):6910-6924.［4］FuruihiK,adaT,IataY,etal.AdinistratinfFR167653,aneanti-inflaatrypund,preventsrenalishaeia/reperfusininjuryinie［J］.NephrlDialTransplant,2002,17(3):399-407.［5］BruardS,BerberatP,TbiashE，etal.Heexygenase-1-derivedarbnnxiderequirestheativatinftransriptinfatrNF-κBtprtetendthelialellsfrturnersisfatr-α-ediatedapptsis［J］.JBilhe,2002,277(20):17950-17961.［6］angY,ay,KrnelukRG,etal.NF-κBantiapptsis:indutinfTRAF1andTRAF2and-IAP1and-IAP2tsuppressaspase-8ativatin［J］.Siene,1998,281(5383):1680-1683.［7］uX,AZ,PrasadKV,etal.IEX-1L,anapptsisinhibitrinvlvedinNF-κB-ediatedellsurvival［J］.Siene,