備課素材：基因定點(diǎn)突變技術(shù)-高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

基因定點(diǎn)突變技術(shù)

基因定點(diǎn)突變的目的是通過(guò)定向地改變基因內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基來(lái)改變多肽鏈上一個(gè)或幾個(gè)氨基酸。該技術(shù)是蛋白質(zhì)工程的重要技術(shù)。基因定點(diǎn)突變技術(shù)主要分為PCR定點(diǎn)突變技術(shù)和不依賴(lài)PCR的定點(diǎn)突變技術(shù)，這兩類(lèi)定點(diǎn)突變技術(shù)互為補(bǔ)充。1、PCR定點(diǎn)突變技術(shù)PCR定點(diǎn)突變技術(shù)是最常用的基因定點(diǎn)突變技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)含有非特異性配對(duì)堿基的引物，再通過(guò)PCR將突變位點(diǎn)引入產(chǎn)物中。PCR定點(diǎn)突變技術(shù)具有突變回收率高、可在任何位點(diǎn)引入突變、材料和試劑容易獲得、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，它又可以分為重疊延伸PCR、大引物PCR等。（1）重疊延伸PCR重疊延伸PCR是發(fā)展最早的PCR定點(diǎn)突變技術(shù)。如圖3-9所示，該技術(shù)要使用四條引物。其中引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)，而這兩條引物有部分堿基（包括突變位點(diǎn)）是可以互補(bǔ)的。因此，分別利用引物1和2，引物3和4進(jìn)行PCR后，得到的DNA片段可以通過(guò)引物2和3互補(bǔ)的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和4進(jìn)行擴(kuò)增得到含有突變位點(diǎn)的DNA片段。通過(guò)測(cè)序可以檢驗(yàn)定點(diǎn)突變是否成功。（2）大引物PCR大引物PCR需要用到三條引物進(jìn)行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物。該技術(shù)的流程如圖3-10所示。第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到不完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴(kuò)增得到完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段。2.不依賴(lài)PCR的定點(diǎn)突變技術(shù)

不依賴(lài)PCR的定點(diǎn)突變技術(shù)的核心是人工合成帶有突變位點(diǎn)的寡核苷酸片段，再借助在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。這類(lèi)技術(shù)中比較成熟的有盒式突變、寡核苷酸引導(dǎo)的突變等。盒式突變的原理是，利用一段人工合成的含有突變位點(diǎn)的雙鏈寡核苷酸片段來(lái)替換目的基因中相應(yīng)的片段，從而在目的基因中引入突變位點(diǎn)。寡核苷酸引導(dǎo)的突變的技術(shù)流程如圖3-11所示。首先人工合成一段含有特定突變位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸片段（除突變位點(diǎn)外，該片段的其他部分可以與目的基因互補(bǔ)配對(duì)）；然后將該寡核苷酸片段與帶有目的基因的單鏈載體（通常由M13噬菌體衍生而來(lái)）進(jìn)行雜交；繼而在DNA聚合酶和DNA連接酶的作用下分別進(jìn)行DNA