實驗技術(shù)-空斑純化方法步驟以及若干問題

實驗技術(shù)-空斑純化方法步驟以及若干問題實驗技術(shù)-空斑純化方法步驟以及若干問題實驗技術(shù)-空斑純化方法步驟以及若干問題xxx公司實驗技術(shù)-空斑純化方法步驟以及若干問題文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計，管理制度材料和試劑：DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞板，中性紅，瓊脂糖，PBS或無抗無血培養(yǎng)基，1ml和10ml移液管等。操作步驟：1PK15細(xì)胞鋪細(xì)胞板，細(xì)胞密度要較高，才容易形成空斑（但太高了也不好，有可能會形成很多層細(xì)胞，導(dǎo)致有的細(xì)胞形成病變的地方有其他層的細(xì)胞沒有壞死也被染色從而無法形成空斑）。2過夜后，用無抗無血的培養(yǎng)基清洗洗吧，然后再進(jìn)行病毒吸附，原液進(jìn)行10倍倍比稀釋，自己可以摸索一下感染稀釋度，一般病毒價較低的時候，可以降低稀釋度。看空斑形成情況，要是空斑形成太大，連成片，就得增加稀釋度。3吸附1-2小時，用無抗無血培養(yǎng)基（或無菌PBS）清洗2-3遍后配制第一次覆蓋液。使用%的瓊脂糖（加熱至液體狀）和兩倍DMEM溶液等體積混合，逐滴加到細(xì)胞板中。沒孔加入1-2ml覆蓋液。放置于37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4每天觀察細(xì)胞病變情況，出現(xiàn)明顯病變時進(jìn)行二次覆蓋，覆蓋液和第一次差不多，只是要加入細(xì)胞染色液中性紅（%），一般體積比為10ml：10ml：1ml（可以適當(dāng)增加一點(diǎn)，如果染色效果不良的話）。5染色5H以上應(yīng)該就可以觀察染色情況，理論上偽狂犬病毒應(yīng)能形成白色空斑而PCV2不會產(chǎn)生空斑。在不知道PCV2在哪里的情況下，我們隨機(jī)挑取若干個沒有空斑的細(xì)胞，而后進(jìn)行傳代。應(yīng)該可以得到無偽狂犬污染的PCV2病毒種。1蝕斑實驗需要細(xì)胞長至什么程度可以接毒？

顯微鏡下觀察，一般情況下，鋪滿細(xì)胞板底部即可，這樣不會造成空洞影響蝕斑觀察。不同的細(xì)胞不一樣，一般時候是長滿T25的細(xì)胞傳一個六孔板，第二天就接毒。

2細(xì)胞上用什么覆蓋物瓊脂瓊脂糖低熔點(diǎn)瓊脂糖濃度應(yīng)該是多大

我用的是lonza公司的低熔點(diǎn)瓊脂糖，終濃度是%。感覺不錯，就是挺貴的，2k+人民幣。

3如果做挑斑純化，是不是就不可以染色，染色后對毒力有何影響？

不染色就可以看出來，因為培養(yǎng)基本身里面就含有酚紅呈現(xiàn)顏色，形成的斑沒有顏色，可以直接挑斑；我也染色后挑過，感覺影響不大，可能不同病毒不一樣吧。

4由于細(xì)胞上有覆蓋物，那么該如何挑斑？

我用的是1ML