乙肝表面抗原定量檢測(cè)與HBV

乙肝表面抗原定量檢測(cè)與HBV-DNA結(jié)果的相關(guān)性分析摘要】目的探討化學(xué)發(fā)光化法乙肝表面抗原定量測(cè)定與HBV-DNA水平及乙肝病毒標(biāo)志物模式之間相互關(guān)系。方法運(yùn)用化學(xué)發(fā)光法、熒光定量PCR(FQ-PCR)及ELISA三種方法同時(shí)檢測(cè)173清標(biāo)本，并對(duì)其結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法加以對(duì)比分析。結(jié)果173例患者血清HBsAg含量與HBV-DNA及乙肝病毒標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，顯示其具有良好的相關(guān)性。結(jié)論化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)HBsAg能較準(zhǔn)確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制情況。【關(guān)鍵詞】乙肝表面抗原乙肝病毒DNA熒光定量PCR酶聯(lián)免疫吸附乙型肝炎病毒是危害最嚴(yán)重的病毒性肝炎之一,我國(guó)是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高發(fā)區(qū)，人群HBV感染率達(dá)60%左右，其中HBV攜帶率約占10%［1］。肝病毒感染的診斷主要依賴于測(cè)定血清中乙肝病毒抗原-抗體標(biāo)志物(乙肝兩對(duì)HBV-M)和乙肝病毒核酸(HBV-DNA)含量(熒光定量PCR檢測(cè))，將其作為臨床分析和判斷乙肝患者病情、療效及預(yù)后的主要依據(jù)，但由于兩對(duì)半組合模式復(fù)雜多樣，導(dǎo)致部分患者的HBV感染復(fù)制狀況難以斷;HBV-DNA雖是乙肝病毒感染和復(fù)制的特異性指標(biāo)，表明其具有傳染性的最有力的證據(jù)［2-3］，但受到實(shí)驗(yàn)室要求的嚴(yán)格限制，無法快速檢測(cè)。本文運(yùn)用化學(xué)發(fā)光法對(duì)173份清標(biāo)本HBsAg作出定量檢測(cè)，并結(jié)合HBV-DNA及兩對(duì)半結(jié)果，希望能對(duì)乙肝患者的臨床診斷、治療及預(yù)后提供及時(shí)、準(zhǔn)確的依據(jù)。1材料與方法1.1標(biāo)本來源:2012年3月至2012年5月間我院住院患者173例(主要是感染科、消化內(nèi)科的病人)，留取靜脈血分離血清，-20°C保存?zhèn)錂z。1.2儀器及試劑:HBsAg定量檢測(cè)所用儀器系美國(guó)雅培公司的i2000SR免疫發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，診斷試劑均由雅培公司提供;HBV-DNA測(cè)定儀系美國(guó)PerkinElmer公司的PE7000自動(dòng)熒光PCR儀，F(xiàn)Q2PCR試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，試劑盒的靈敏度為200copies/ml;HBV-MELISA診斷試劑盒由上海科華生物技術(shù)有限公司提供1.3檢測(cè)方法:將-20C冷凍保存的標(biāo)本取出解凍復(fù)融。173份按乙肝兩對(duì)半不同模式分為8組，見表1。用生理鹽水以不同的稀釋倍數(shù)稀釋各組血清樣本:乙肝大三陽組按1:500稀釋，乙肝小三陽組和HBsAg(+)、HBcAb(+)組按1:20稀釋，其余組均以原倍檢測(cè)。將稀釋好的血清標(biāo)本嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，測(cè)定HBsAg含量，單位為IU/ml。1.4數(shù)據(jù)處理:將測(cè)得的各組HBV-DNA拷貝數(shù)及HBsAg含量(IU/ml)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，并以-x±s表示，以HBV-DNA對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),HBsAg數(shù)值為縱坐標(biāo)，求線性回歸及相關(guān)系數(shù)(r)。2結(jié)果(表-1)2.1HBsAg定量與乙肝兩對(duì)半及HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果比較見表-1。2.2乙肝表面抗原含量與HBV-DNA相關(guān)性分析：以HBV-DNA為橫坐標(biāo)，HBsAg為縱坐標(biāo)，發(fā)現(xiàn)二者存在明顯的正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)(r)=0.93，當(dāng)HBsAg>300IU/ml(102.5=300)，HBV-DNA即可出現(xiàn)陽性。3討論化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測(cè)定是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的一類免疫測(cè)定方法，其檢測(cè)結(jié)果具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性佳、檢測(cè)快速、無放射性危害等優(yōu)點(diǎn)［4-5］。雅培i2000SR系統(tǒng)是基于化學(xué)微粒子免疫分析(CMIA)檢測(cè)技術(shù)的全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)，以吖啶酯作為標(biāo)記發(fā)光劑，能夠?qū)σ腋蝺蓪?duì)半作出定量、準(zhǔn)確、快速的分析。本文應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)我院住院患者173例血清標(biāo)本，作乙肝表面抗原定量分析，發(fā)現(xiàn)其與乙肝兩對(duì)半HBV-DNA具有良好的相關(guān)性。乙肝大三陽組45例中，44例HBV-DNA陽性，表明HBV均有活動(dòng)性復(fù)制［6-8］，我們測(cè)得的DNA陽性組HBsAg含量為7.2±2.02IU/ml,其中1例HBV-DNA陰性患者，測(cè)得的HBsAg僅為2.85IU；36例小三陽組中，19例HBV-DNA陽性，說明小三陽患者只有半數(shù)左右人群體內(nèi)含有HBV-DNA，而我們測(cè)得的19例HBV-DNA陽性者HBsAg為3.13±1.30IU/ml,與DNA陰性者2.15±0.60IU/ml有顯著性差異，說明小三陽患者乙肝表面抗原的高低可反映體內(nèi)HBV活動(dòng)性復(fù)制的情況及水平;25例HBsAg(+)、抗-HBc(+)患者血清HBV-DNA陽性率達(dá)48%，HBsAg測(cè)定值為3.01±0.64IU/ml，與小三陽患者無明顯差異，可能為血清轉(zhuǎn)換期或前C區(qū)突變［9-10］，如果經(jīng)過動(dòng)態(tài)觀察仍表現(xiàn)為HBsAg(+)、抗-HBc(+)及HBV-DNA陽性，可能為前C區(qū)突變。因此，我們可通過HBsAg水平動(dòng)態(tài)觀察該部分患者；10例抗-HBs(+)者無1例HBV-DNA陽性，我們測(cè)得的HBsAg水平也與之相符，結(jié)果為0，說明抗-HBs為保護(hù)性抗體;表中5?7組是乙肝恢復(fù)期或既往感染乙肝的模式，F(xiàn)Q-PCR檢測(cè)結(jié)果表明這些患者中仍有少數(shù)人存在低水平的病毒復(fù)制，雖然我們未檢出HBsAg，但有文獻(xiàn)報(bào)道［11］，隨時(shí)間的推移，這部分患者通常在恢復(fù)期早期仍有較高HBV-DNA檢出率，隨時(shí)間推移，陽性率慢慢下降，因此即使未檢出HBsAg，對(duì)于這部分患者的診斷和治療亦影響不大;對(duì)于20例陰性患者，HBV-DNA分析結(jié)果與HBsAg定量結(jié)果基本一致。因此認(rèn)為，HBsAg定量結(jié)果能夠較準(zhǔn)確地反映HBV在人體內(nèi)的復(fù)制情況。同時(shí)，我們對(duì)HBV-DNA與HBsAg的含量水平進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者存在明顯的正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.93，表明HBsAg水平越高，HBV-DNA含量亦越高，當(dāng)HBsAg約＞300IU/ml，HBV-DNA即可出現(xiàn)陽性，因此，可將治療前后的HBsAg水平變化作為療效評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。存在的問題：乙肝病毒感染的診斷主要依賴于測(cè)定血清中乙肝病毒抗原-抗體標(biāo)志物和乙肝病毒核酸(HBV-DNA)含量，乙肝DN乙肝病毒在患者血清中有三種存在形式:球形顆粒、管形顆粒和完整的Dana病毒顆粒［12］。Dana顆粒中含有HBV-DNA，而球形、管形顆粒不含DNA。化學(xué)發(fā)光測(cè)定為乙肝病毒所編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)(多肽)抗原或相應(yīng)抗體，當(dāng)病毒抗原-抗體在血清中達(dá)到一定濃度即可檢出這些標(biāo)志物，但受其它因素影響(血清中含有纖維絲、紅細(xì)胞脆片、HAMA效應(yīng)等)［13］。因此,乙肝病毒所編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原或相應(yīng)抗體陰性或假陽性結(jié)果由多種原因造成的，臨床診斷應(yīng)根據(jù)HBV-DNA定性或定量及乙肝表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果綜合分析。綜上所述，乙肝患者HBsAg水平能夠較準(zhǔn)確地反映HBV在人體內(nèi)的復(fù)制情況。由于化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)法具有快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，有可能取代ELISA法乙肝兩對(duì)半定性及熒光PCR，在乙肝的診療中，有助于疾病的觀察、用藥，提高療效及判斷預(yù)后。參考文獻(xiàn)［1］ 葉維洪，鐘振義.肝炎學(xué)大典.天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社,1996.463-515.［2］ 嚴(yán)根寶，蒲瑞連，顧建人，等.聚合酶鏈反應(yīng)直接檢測(cè)HBV-DNA方法改進(jìn).中華傳染病雜志，1992,10⑵：125-126.張麗民.化學(xué)發(fā)光標(biāo)記及發(fā)光免疫分析.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,1995,15(4):201-202.⑷陳鶯，陳建森.熒光定量檢測(cè)HBV-DNA與ELISA法測(cè)兩對(duì)半相關(guān)性分析.福建醫(yī)藥雜志，2003，25⑵:118.蔡衛(wèi)平，唐小平，陳勁峰，等.慢性乙型肝炎抗HBV-DNA定量檢測(cè)與病原學(xué)標(biāo)志和肝損害程度的關(guān)系.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志,1998，18⑵：149.RodriguezFE，ButiM，JardiR，etal.HepatitisBvirusinfectionpre-coremutantsanditsrelationtoviralgenotypesandcoremutations.Hepatology，1955，22:1641-1647.LoriotMA，MarcellinP，BismuthE，etal.DemonstrationofhepatitisBvirusDNAbypolymerasechainreactionintheserumandtheliverafterspontaneousortherapeuticallyinducedHBeAgtoanti-HbeorHBeAgtoanti-HBsseroconversioninpatientswithchornichepatitisB.Hepatology，2002，15(1):32-36陳瑜,李蘭娟.三種自動(dòng)化免疫分析系統(tǒng)測(cè)定HBV血清標(biāo)志物結(jié)果比較.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),2004,25(1):325.PalladinoS,KayI，F(xiàn)onteR,etal.Useofreal2timePCRandthelightcyclersystemfortherapiddetectionofpneumocystiscariniiinrespiratoryspecimens.DiagnMicrobiolInfectDis，2010，39:2332236.KaoJH,WoodM,ChenPJ,etal.ComparisonoftwomethodsforquantificationofhepatitisBvirusDNA.JGastroenterolHepatol,2009,14⑸:4232426.HeijtinkRA，SchneebergerPM，PostmaB,etal.Anti-HBslevelsafterhepatitisBimmunisationdependontestreagents:routinelydetermined10and100U/Lseroprotectionlevelsofunreliablevaccine,2005,20:28