03物理圖譜與測序2公開課一等獎(jiǎng)省優(yōu)質(zhì)課大賽獲獎(jiǎng)?wù)n件

第三章

DNA物理圖譜構(gòu)建及序列測定物理圖譜（physicalmap）物理圖/限制性圖譜（restrictionmap）是各種限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)在某一DNA分子或DNA片段上排列，因?yàn)楦髅盖悬c(diǎn)之間距離是以堿基對（kbp→mbp）表示，所以可計(jì)算出二切點(diǎn)間絕對距離，所以限制圖也稱物理圖。物理圖譜構(gòu)建是基因組研究主要組成部分。質(zhì)粒pBR322限制圖一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）

細(xì)菌核酸內(nèi)切酶識別、剪切特殊雙鏈DNA序列用途：DNA物理圖譜構(gòu)建、DNA序列分析、基因分離、基因定位、DNA重組1.細(xì)菌修飾作用和限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)覺20世紀(jì)50年代，Luria&Human、Bertani&Weigle：噬菌體→細(xì)菌菌株1，正常生長?！?xì)菌菌株2，生長受到強(qiáng)烈抑制；少數(shù)存活，再次感染菌株2，正常生長——受到宿主特意修飾。機(jī)制？E.coli菌株λ噬菌體感染率KBCE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111111962，Arber：宿主修飾在噬菌體DNA上進(jìn)行1965，Arber：宿主對入侵噬菌體修飾與噬菌體DNA降解親密相關(guān)；預(yù)言細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶；修飾是宿主甲基化酶作用結(jié)果：建立細(xì)菌限制-修飾（R-M）系統(tǒng)概念。Arber假說細(xì)菌中存在含有相同位點(diǎn)特異性2種酶：限制性內(nèi)切核酸酶；甲基化酶細(xì)菌限制-修飾系統(tǒng)是抵抗外來侵襲一個(gè)主要辦法1978年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)覺1968年，Linn&Arber于大腸桿菌B中發(fā)覺第一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶（I型：識別特異剪切隨機(jī)）。1968年，Meselson&Yuan從大腸桿菌K中取得高純度限制性內(nèi)切核酸酶（I型）。1970年，Smith從流感嗜血桿菌Rd中分離出第一個(gè)II型限制性內(nèi)切核酸酶——HindII。流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）能快速降解外源噬菌體DNA，其細(xì)胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解本身DNA，→HindⅡ限制性內(nèi)切酶。HindⅡ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和切割位點(diǎn)以下：

5'…GTPy↓PuAC…3'

3'…CAPu↑PyTG…5'

上世紀(jì)80年代，限制性內(nèi)切酶開始克隆表示限制-修飾系統(tǒng)Smith等工作流感嗜血桿菌Rd與其它細(xì)菌相同DNA堿基化程度低：m5C，N6-mA；但存在甲基化酶細(xì)胞粗提物→磷酸纖維素層析→蛋白；*

S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移甲基→魚精DNA/T7DNA?！獧z測出4種腺嘌呤甲基化酶其中一個(gè)處理T7DNA→免受HindII裂解；先用HindII處理魚精DNA→對應(yīng)甲基化位點(diǎn)破壞?！拗菩詢?nèi)切酶-修飾性甲基化酶共識別位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)處甲基基團(tuán)伸入到雙螺旋大溝中去，妨礙了限制性內(nèi)切酶作用。磷酸纖維素層析——陽離子交換層析氨基酸等點(diǎn)點(diǎn)（isoelectricpoint，pI）

在一定pH條件下，氨基酸分子中所帶正電荷和負(fù)電荷數(shù)相等，即凈電荷為零，此時(shí)溶液pH稱為該氨基酸等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)

。氨基酸在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小。正離子pH<pI兩性離子pH=pI負(fù)離子pH>pI離子交換層析分離蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶催化甲基化（methylation）甲基供體：S-腺苷甲硫氨酸甲基受體：被修飾堿基（A、C多于G、T）堿基甲基化修飾不是隨機(jī)，而是限于一定次序或DNA某一區(qū)域，在甲基化酶作用下進(jìn)行，甲基化是可逆。甲基化意義：幫助細(xì)胞識別和區(qū)分本身DNA和外來DNA；調(diào)整基因表示；幫助DNA修復(fù)等。腺苷轉(zhuǎn)移酶PPi+Pi+甲硫氨酸ATPS-腺苷甲硫氨酸(S-腺苷Met，SAM)S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶RHR—CH3腺苷SAMS—腺苷同型半胱氨酸同型半胱氨酸SAM為體內(nèi)甲基直接供體

H2O腺苷或胞嘧啶甲基化是各種細(xì)菌限制修飾系統(tǒng)一部份

真核生物中也存在廣泛DNA甲基化修飾現(xiàn)象

哺乳動(dòng)物DNA甲基化修飾和X染色體失活、胚胎發(fā)育、組織分化乃至癌癥親密相關(guān)。真核生物，修飾則影響基因表示。大多數(shù)情況下，甲基化修飾造成基因表示緘默。而且這種修飾在細(xì)胞有絲分裂時(shí)能夠代代傳遞新遺傳學(xué)分枝--表觀遺傳學(xué)2.限制性內(nèi)切酶種類與特征限制性內(nèi)切酶形式多樣大?。篜vuII（157個(gè)氨基酸）；CjeI（1250個(gè)氨基酸）。純化分類3000余種限制性內(nèi)切酶，超出250種特異識別序列。研發(fā)工作仍在繼續(xù)：分析細(xì)胞提取物，計(jì)算機(jī)分析已知基因組數(shù)據(jù)。同裂酶（識別序列與已經(jīng)有重復(fù)）；新識別位點(diǎn)傳統(tǒng)上將限制性內(nèi)切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點(diǎn)、輔助因子等原因劃分為三大類。然而，蛋白測序結(jié)果表明，限制性內(nèi)切酶改變各種多樣，若從分子水平上分類，則應(yīng)該遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這三種。

I型限制性內(nèi)切酶

兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性多亞基蛋白復(fù)合體(3x105-4x105Da)，需Mg2+、ATP、SAM。在識別位點(diǎn)很遠(yuǎn)地方任意切割DNA鏈：EcoB識別位點(diǎn)——TGA*（N）8TGCT；EcoK識別位點(diǎn)——AA°C（N）6GTGC（A為可能甲基化位點(diǎn)，N表示任意堿基）。切割位點(diǎn)在識別位點(diǎn)1000bp以外，且無特異性。不產(chǎn)生確定限制片段，不具備實(shí)用性。II型限制性內(nèi)切酶種類多（2x104-10x104），需Mg2+激活絕大多數(shù)Ⅱ酶識別序列/切割位點(diǎn)由4～8個(gè)核苷酸多以同二聚體結(jié)合于DNA，識別對稱序列；極少作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續(xù)序列（EcoRI：GAATTC）；另一些識別不連續(xù)序列（BglI：GCCNNNNNGGC）。切割后產(chǎn)生一個(gè)3‘羥基端和一個(gè)5’磷酸基團(tuán)對應(yīng)修飾酶需要S-甲硫氨酸腺苷存在IIS型限制性內(nèi)切酶Ⅱ型含有相同輔因子要求，但識別位點(diǎn)是非對稱，也是非間斷，長度為4-7bp，切割位點(diǎn)可能在識別位點(diǎn)一側(cè)20bp范圍內(nèi)（如FokI和AlwI）。III型限制性內(nèi)切酶兼有限制-修飾兩種功效，需Mg2+、ATP；當(dāng)ATP、SAM同在時(shí)，DNA分解與甲基化同時(shí)進(jìn)行識別位點(diǎn)之外切開DNA鏈：EcoP1和EcoP15識別位點(diǎn)分別是AGACC和CAGCAG，切割位點(diǎn)則在下游24-26bp處。極少能產(chǎn)生完全切割片段，不具備實(shí)用價(jià)值。3.識別位點(diǎn)序列測定1970年，Smith建立：堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase）T4多聚核苷酸激酶（T4PolynucleotideKinase）胰腺脫氧核糖核酸酶（DNaseI）蛇毒磷酸二酯酶（snakevenomphosphodiesterase）電泳堿性磷酸酶T4多聚核苷酸激酶T4多核苷酸激酶是一個(gè)磷酸化酶，可將ATPg-磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA5'末端。

牛胰脫氧核糖核酸酶（DNaseI）嘧啶嘌呤嘧啶嘌呤蛇毒磷酸二酯酶4.影響限制性內(nèi)切酶活性原因*DNA純度DNA制備過程中污染：蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、高濃度鹽離子等，都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶活性。對策：①增加核酸內(nèi)切限制酶用量，平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多。

②擴(kuò)大酶催化反應(yīng)體積，以使?jié)撛谝种圃虮粚?yīng)地稀釋。

③延長酶催化反應(yīng)保溫時(shí)間。內(nèi)切酶活力單位1U定義為37℃、1h內(nèi)完全分解1μgλ-DNA所需酶量。

理論用量：1μgλ-DNA只需1U酶作用1h；實(shí)際用量：2U，2h樣品含酶抑制劑，重新純化限量用酶——非特異性核酸酶活性Dnase污染（活性需Mg2+，DNA儲存緩沖液含EDTA）*DNA甲基化程度從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA通?；煊校篸am甲基化酶，G*ATC；dcm甲基化酶，C*CA/TGG基因克隆中使用失去了甲基化酶大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA，防止被核酸內(nèi)切限制酶局部消化，甚至完全不被消化。核酸內(nèi)切限制酶不切割甲基化核苷酸序列應(yīng)用：甲基化酶識別序列同一些限制酶識別序列相鄰，抑制在這些位點(diǎn)發(fā)生切割作用，改變核酸內(nèi)切限制酶識別序列特異性；經(jīng)過甲基化作用將內(nèi)部限制酶識別位點(diǎn)保護(hù)起來。*酶切消化反應(yīng)溫度

大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃，但也有許多例外情況，比如SmaⅠ是25℃、MaeⅠ是45℃。消化反應(yīng)溫度低于或高于最適溫度，都會影響核酸內(nèi)切限制酶活性，甚至最終造成完全失活。*DNA分子結(jié)構(gòu)

DNA分子不一樣構(gòu)型對核酸內(nèi)切限制酶活性也有很大影響。一些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要酶量，要比消化線性DNA高出許多倍，最高可達(dá)20倍。

另外，還有一些核酸內(nèi)切限制酶，切割它們自己處于不一樣部位限制位點(diǎn)，其效率亦有顯著差異?！稽c(diǎn)偏愛（Sitepreference）位點(diǎn)偏愛（Sitepreference）

EcoRⅠ酶切割噬菌體中5個(gè)位點(diǎn)時(shí)不是隨機(jī)，靠近右端位點(diǎn)比分子中間位點(diǎn)切割快10倍；EcoRⅠ和HindⅢ在噬菌體DNA中切割速率分別有10倍和14倍差異。噬菌體DNA有4個(gè)SacⅡ位點(diǎn)，三個(gè)在中央，一個(gè)在右臂，對中央三個(gè)位點(diǎn)酶切速度快50倍。

EcoRⅠ對腺病毒2DNA不一樣位置切點(diǎn)切割速率也不一樣。

*核酸內(nèi)切限制酶緩沖液

核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)緩沖液組份包含氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris-HCL、β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。Mg2+作用是提供二價(jià)陽離子。緩沖液Tris-HCL使反應(yīng)混合物pH恒定在酶活性所要求最正確數(shù)值范圍之內(nèi)。巰基試劑對于保持一些核酸內(nèi)切限制酶穩(wěn)定性是有用，而且還可保護(hù)其免于失活。不一樣酶對離子強(qiáng)度要求差異很大，并依次將限制酶緩沖液按離子強(qiáng)度差異分為高、中、低三種類型，離子強(qiáng)度以NaCl來滿足，濃度分別為100mM、50mM和0mM。NEBuffer1（黃色）：

10mMBisTris丙烷-HCl,10mMMgCl2,1mMDTT（pH7.0@25℃）。NEBuffer2（藍(lán)色）：

10mMTris-HCl,10mMMgCl2,50mMNaCl,1mMDTT（pH7.9@25℃）。NEBuffer3（紅色）：

50mMTris-HCl,10mMMgCl2,100mMNaCl,1mMDTT（pH7.9@25℃）。NEBuffer4（綠色）：

20mMTris-Ac,10mMMg(Ac)2,50mMKAc,1mMDTT（pH7.9@25℃）。寶生物企業(yè)緩沖液特殊緩沖液：NEBufferEcoRI：

50mMNaCl,100mMTris-HCl,10mMMgCl2,0.025%TritonX-100（pH7.5@25℃）雙酶切緩沖液選擇5.星星活性（staractivity）

在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識別序列相同序列，這個(gè)改變特殊性稱星星活性。引發(fā)星星活性原因：甘油濃度高（>5%）；酶過量（>100U/l）；離子強(qiáng)度低（<25mM）；pH值過高（>8.0）；加入了有機(jī)溶劑如二甲基亞砜、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；用其它二價(jià)陽離子如Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替了Mg2+。不一樣酶對上述條件敏感性不一樣，如PstⅠ比EcoRⅠ對高pH更敏感，但后者對甘油濃度更敏感。二、構(gòu)建物理圖譜克隆載體構(gòu)建物理圖譜基本策略：將基因組DNA片段與載體整合進(jìn)行克隆，取得重合克隆群。載體基本條件：自主復(fù)制原點(diǎn)，在宿主高效表示、穩(wěn)定遺傳；單克隆位點(diǎn)；篩選標(biāo)識①質(zhì)粒載體②柯斯質(zhì)粒黏粒（cosmid）——人工構(gòu)建含有λ噬菌體DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子載體。cos序列是噬菌體DNA中將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需DNA序列。1978年Collins&Hohn等為克隆真核DNA大片段構(gòu)建（質(zhì)粒外源基因容量-10Kb）組成包含質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ColE1）、氨卡青霉素抗性標(biāo)識、cos位點(diǎn)。黏粒特點(diǎn)含有λ噬菌體特征。黏粒在克隆了外源DNA在體外包裝成噬菌體顆粒后，能夠感染宿主菌并在細(xì)菌內(nèi)按照λ噬菌體DNA方式環(huán)化起來。但黏粒載體不含有λ噬菌體全部必要基因，所以不會使宿主菌裂解，無法形成子代噬菌體顆粒。含有質(zhì)粒特征。黏粒含有質(zhì)粒復(fù)制子，可在宿主菌內(nèi)像質(zhì)粒DNA一樣進(jìn)行復(fù)制?？寺⊥庠碊NA容量大。黏粒本身相對較小，普通只有5～7kb，而最大克隆片段可達(dá)45kb左右。能與有同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組。黏?？寺≈饕眍愃剖删w載體。與外源片段連接時(shí)，粘粒載體相當(dāng)于噬菌體載體左右臂，cos位點(diǎn)經(jīng)粘端退火，與外源片段相間連接成多聯(lián)體。多聯(lián)體與噬菌體包裝蛋白混合時(shí)，噬菌體A基因蛋白末端酶功效將切割兩個(gè)cos位點(diǎn)，并將兩個(gè)同方向cos位點(diǎn)之間片段包裝到噬菌體顆粒。這些噬菌體顆粒感染大腸桿菌時(shí)，線狀重組DNA如噬菌體DNA被注入細(xì)胞并經(jīng)過cos位點(diǎn)環(huán)化，形成完整粘粒載體，可象質(zhì)粒一樣復(fù)制并使宿主取得抗藥性。與噬菌體載體不一樣，外源片段克隆在粘粒載體中以菌落形式表現(xiàn)出來，非噬菌斑。這種菌落總和組成基因文庫。上述帶有外源片段重組粘粒，可經(jīng)過輔助噬菌體感染或誘導(dǎo)潛伏原噬菌體生長，重組粘粒cos位點(diǎn)可作為包裝底物，造成重組粘粒DNA被包裝到噬菌體顆粒中去。這些轉(zhuǎn)導(dǎo)性顆粒從細(xì)胞中釋放出來，既可無限期貯存，也可直接感染其它菌株。

③酵母人工染色體

（Yeastartificialchromosomes

YAC）利用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）染色體復(fù)制元件構(gòu)建載體。釀酒酵母形態(tài)為扁圓形和卵形，生長代時(shí)為90分鐘；含16條染色體，其大小為225-1900kb，總計(jì)有14×106bp；具真核mRNA加工活性。

人工染色體必備結(jié)構(gòu)元件自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicationsequences，ARS）：含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須信號；著絲粒（centromere，CEN）：負(fù)責(zé)染色體向子細(xì)胞傳遞；端粒（telomere，TEL）：對染色體DNA末端起保護(hù)作用。YAC載體——pYAC4

YAC載體工作原理YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫（高等真核生物基因組文庫），不用作常規(guī)基因克隆。BamHⅠ切割pYAC4形成微型酵母染色體，含染色體復(fù)制必要順式元件，可攜帶酵母染色體大小DNA片段。BamHⅠ切割后形成微型酵母染色體，用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4內(nèi)部位點(diǎn)形成染色體兩條臂，與外源大片段DNA相連形成大型人工酵母染色體，轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中去，到達(dá)克隆大片段DNA目標(biāo)。裝載外源DNA片段重組子造成抑制基因sup4插入失活，形成紅色菌落；載體自連形成白色菌落。裝載不一樣外源DNA片段紅色重組酵母菌菌落群體就組成YAC文庫。YAC文庫裝載DNA片段大小普通可達(dá)200-500kb，有可達(dá)1Mb以上，甚至到達(dá)2Mb。

YAC載體缺點(diǎn)存在嵌合現(xiàn)象，即一個(gè)YAC克隆中插入子可能來自兩個(gè)或多個(gè)不一樣片段（嵌合克隆約占總克隆5%～50%）。YAC克隆穩(wěn)定性差，插入片段會出現(xiàn)缺失（deletion）和基因重（rearrangement）現(xiàn)象。YAC染色體與宿主細(xì)胞染色體大小相近，插入片段分離、純化較困難，轉(zhuǎn)化效率亦較低。缺失和插入重排（rearrangement）DNA分子內(nèi)較大片段交換，稱為重組或重排。

④細(xì)菌人工染色體（BAC）基于大腸桿菌F質(zhì)粒構(gòu)建，高通量低拷貝質(zhì)粒載體。每個(gè)環(huán)狀DNA分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo)識，一個(gè)起源于大腸桿菌F因子（致育因子）嚴(yán)謹(jǐn)型控制復(fù)制子oriS（Shizuyaetal.1992），一個(gè)易于DNA復(fù)制由ATP驅(qū)動(dòng)解旋酶（（RepE）以及三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒準(zhǔn)確分配至子代細(xì)胞基因座（parA,parB,和parC）。BAC載體容量100-350Kb

F質(zhì)粒

大腸桿菌F因子是一個(gè)約100kb質(zhì)粒。編碼60各種參加復(fù)制、分配和接合過程蛋白質(zhì)（WillettsandSkurray，1987）。即使F因子通常以雙鏈閉環(huán)DNA（1-2個(gè)拷貝/細(xì)胞）形式存在，但它能夠在大腸桿菌染色體中最少30個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行隨機(jī)整合（Low，1987）。攜帶F因子細(xì)胞，或以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)表示三根發(fā)樣狀F菌毛。F菌毛為供體與受體細(xì)胞之間產(chǎn)生性接觸所必需。第一代BAC載體（Shizuyaetal.1992）不含能用于區(qū)分?jǐn)y帶重組子抗生素抗性細(xì)菌菌落與攜帶空載體細(xì)菌菌落標(biāo)識物。新型BAC載體能夠經(jīng)過α互補(bǔ)原理篩選含有插入片段重組子，并設(shè)計(jì)了用于回收克隆DNANotⅠ酶切位點(diǎn)和用于克隆DNA測序Sp6開啟子、T7開啟子（Kimetal.1996;Asakawaetal.1997）。NotⅠ識別序列，位點(diǎn)十分稀少。重組子經(jīng)過NotⅠ消化后，能夠得到完整插入片段。Sp6、T7是起源于噬菌體開啟子，用于插入片段末端測序。BAC載體空載時(shí)大小約7.5kb，在大腸桿菌中以質(zhì)粒形式復(fù)制，含有一個(gè)氯霉素抗性基因。外源基因組DNA片段能夠經(jīng)過酶切、連接克隆到BAC載體多克隆位點(diǎn)上，經(jīng)過電穿孔方法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌重組缺點(diǎn)型菌株。裝載外源DNA后重組質(zhì)粒經(jīng)過氯霉素抗性和LacZ基因α–互補(bǔ)篩選。BAC載體優(yōu)點(diǎn)以大腸桿菌為宿主，電轉(zhuǎn)化，效率高BAC載體以超螺旋形式存在于大腸桿菌，提取方便；復(fù)制子源自F質(zhì)粒，遺傳穩(wěn)定，嵌合、重組少；DNA單拷貝存在，適于傳統(tǒng)菌落培養(yǎng)，可采取菌落原位雜交篩選目地基因；克隆位點(diǎn)兩側(cè)有T7和SP6開啟子，可制備RNA探針或?qū)Σ迦肫螠y序。菌落原位雜交篩選目地基因E.coliRNA聚合酶結(jié)構(gòu)

E.coli只有一個(gè)RNA聚合酶

全酶（holoenzyme）:

α2ββ′ωσ

(450kD)關(guān)鍵酶（coreenzyme）：α2ββ′ω

大腸桿菌RNA聚合酶全酶識別并結(jié)合于開啟子三、基因組研究相關(guān)圖譜遺傳圖譜物理圖譜基因圖譜序列圖譜1.遺傳圖譜（geneticmap）/遺傳連鎖圖/連鎖圖譜（linkagemap）以含有遺傳多態(tài)性（在一個(gè)遺傳位點(diǎn)上具一個(gè)以上等位基因，在群體中出現(xiàn)頻率皆高于1%）遺傳標(biāo)識為“路標(biāo)”，以遺傳學(xué)距離（在減數(shù)分裂事件中兩個(gè)位點(diǎn)之間進(jìn)行交換、重組百分率，1%重組率稱為1cM）為圖距基因組圖。6000多個(gè)遺傳標(biāo)識將人基因組分成6000多個(gè)區(qū)域，使連鎖分析法能夠找到某一致病或表現(xiàn)型基因與某一標(biāo)識鄰近（緊密連鎖）而定位。是定位疾病基因和分析基因是個(gè)關(guān)鍵。

遺傳圖——基因定位遺傳圖譜DNA標(biāo)識

第1代標(biāo)識：經(jīng)典遺傳標(biāo)識，以蛋白質(zhì)或免疫學(xué)多態(tài)性位點(diǎn)為標(biāo)識?！獦?biāo)識位點(diǎn)與所研究性狀間連鎖關(guān)系。ABO血型位點(diǎn)標(biāo)識，HLA（人類白細(xì)胞抗原）位點(diǎn)標(biāo)識?！阎鄳B(tài)性蛋白位點(diǎn)少，技術(shù)復(fù)雜、準(zhǔn)確性差。70年代，限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）：群體中不一樣個(gè)體DNA序列僅有約1%差異——DNA多態(tài)性位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)變異——（RFLP）。限制性片段長度多態(tài)性第2代標(biāo)識

80年代，微衛(wèi)星中心（minisatellitecore）、可變串聯(lián)重復(fù)VNTR（variablenumberoftandemrepeats）提供不一樣長度重復(fù)片段（6~12個(gè)核苷酸——1989年微衛(wèi)星標(biāo)識（microsatellitemarker）系統(tǒng)發(fā)覺和建立，結(jié)合PCR技術(shù)——簡單序列長度多態(tài)性（simplesequencelengthpolymorphism，SSLP），擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）等。微衛(wèi)星（microsatellite）標(biāo)識微衛(wèi)星又稱為簡單重復(fù)序列（simplesequencerepeat，SSR）。這種重復(fù)序列重復(fù)單位很短，經(jīng)常只有2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)核苷酸如一條染色體TCTGAGAGAGACGC另一染色TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就組成了多態(tài)性。第3代標(biāo)識90年代，單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)：指染色體基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引發(fā)DNA序列多態(tài)性，含有分布廣、密度高（人類基因組中每1000個(gè)核苷酸就有一個(gè)SNP）、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)。

果蠅連鎖圖14號染色體遺傳圖譜上家系定位示意圖

7號染色體上已定位遺傳病

疾病基因確定2.物理圖譜基因組DNA限制性酶切片段排列次序圖酶切片段在DNA鏈上定位基因組中基因間次序顯性化比遺傳圖譜分辨率更高是從遺傳圖到序列圖中間圖譜核苷酸序列不一樣DNA，經(jīng)酶切后產(chǎn)生不一樣長度DNA片段，由此組成獨(dú)特酶切圖譜。

3.序列圖譜

包含制備DNA片段化及堿基分析、DNA信息翻譯多階段過程。經(jīng)過測序得到基因組序列圖譜。大規(guī)模測序基本策略:

逐一克隆法：對連續(xù)克隆系中排定BAC克隆逐一進(jìn)行亞克隆測序并進(jìn)行組裝（公共領(lǐng)域測序計(jì)劃）。

全基因組鳥槍法：在一定作圖信息基礎(chǔ)上，不經(jīng)大片段連續(xù)克隆系構(gòu)建，直接將基因組分解成小片段隨機(jī)測序，利用超級計(jì)算機(jī)進(jìn)行組裝（美國Celera企業(yè)）。

逐一克隆法鳥槍法4.基因圖譜

在識別基因組所包含蛋白質(zhì)編碼序列基礎(chǔ)上繪制結(jié)合相關(guān)基因序列、位置及表示模式等信息圖譜。判別出全部基因位置、結(jié)構(gòu)與功效，最主要方法是經(jīng)過基因表示產(chǎn)物mRNA反追到染色體位置。能有效地反應(yīng)在正?；蚴芸貤l件中表示全基因組時(shí)空圖。能夠了解某一基因在不一樣時(shí)間不一樣組織、不一樣水平表示；也能夠了解一個(gè)組織中不一樣時(shí)間、不一樣基因中不一樣水平表示，還能夠了解某一特定時(shí)間、不一樣組織中不一樣基因不一樣水平表示。

對基因轉(zhuǎn)錄表示產(chǎn)物mRNA互補(bǔ)cDNA（其片段稱為表示序列標(biāo)簽，EST）進(jìn)行大規(guī)模測序是序列標(biāo)簽位點(diǎn)主要起源，并以此構(gòu)建人類基因組轉(zhuǎn)錄圖（基因圖）。AportionoftheE.colichromosomeshowinggenesandoperons.

Adotindicatesthepromoterforeachgeneoroperon.Arrowsandcolorindicatethedirectionoftranscribtion:darkbluegenesaretranscribedlefttoright,lightbluearetranscribedrighttoleft.Overlappinggeneareshowningreen.四、構(gòu)建DNA物理圖譜方法完整物理圖譜包含：人類基因組不一樣載體DNA克隆片段重合群圖；大片段限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)圖；DNA片段或異DNA序列（sequencetagssite，STS）路標(biāo)圖；基因組中廣泛存在特征型序列（如CpG序列、Alu序列，isochore）等標(biāo)識圖?；驹硎前妖嫶鬅o從下手DNA先“敲碎”，再拼接。以Mb、kb、bp作為圖距，以DNA探針STS（sequencetagssite）序列為路標(biāo)。主要方法限制性核酸內(nèi)切酶降解法部分變性法DNA聚合酶法雜交電鏡法（環(huán)形成法）末端標(biāo)識法1.限制性核酸內(nèi)切酶降解法部分酶解法交叉酶解法部分酶解法2個(gè)基本步驟完全降解：限制性內(nèi)切酶將放射性標(biāo)識DNA完全降解，經(jīng)凝膠電泳分離后進(jìn)行自顯影，圖譜顯示組成該DNA鏈酶切片段數(shù)目和大小。部分降解：末端標(biāo)識DNA一條鏈，以相同酶部分降解（控制反應(yīng)條件使——酶量、溫度、時(shí)間DNA鏈上該酶切口隨機(jī)斷裂），電泳分離及自顯影。比較2個(gè)自顯影圖譜，依據(jù)片段大小及彼此間差異排出酶切片段在DNA鏈上位置——片那段重合。

一線性DNA片斷長18.1kb，EcoRI完全消化后電泳，得8個(gè)片段，部分消化產(chǎn)生15個(gè)片斷。完全消化片斷：A(4.6),B(4.0),C(3.3),D(2.5),E(2.0),F(1.0),G(0.5),H(0.2)部分消化片斷:

6.66.55.34.64.24.03.83.53.32.52.01.0

0.70.50.2部分消化大片斷是完全消化小片斷之和，可推測：6.6=2+4.6（E+A）；

6.5=2.5+4.0（D+B）；5.3=2+3.3（E+C）；3.8=0.5+3.3（G+C）；0.7=0.2+0.5（G+H）；4.2=0.2+4（B+H）或4.2=0.2+0.5+1.0+2.5（H+F+G+D）；3.5=1.0＋2.5（F+D）或3.5=0.2+3.3（H+C）

或3.5=0.5+1.0+2.0（G+F+E）AECGHFDB4.62.03.32.54.00.50.21.0EcoRI在此DNA片段上酶切圖譜交叉酶解法AB2kb5kb3kbDNA片段總長3kbEcoRⅠ：1.7，0.9，0.4HpaⅡ：1.6，1.4EcoRⅠ+HpaⅡ：1.2,0.9,0.5,0.4HpaⅡ一個(gè)切點(diǎn)EcoRⅠ1.7kb片段不在末端-無0.2、0.1片段EcoRⅠ0.9和0.4kb都在末端→→2.部分變性法DNA分子各區(qū)域AT含量不一樣，部分變性后，富含AT區(qū)出現(xiàn)電鏡下可見環(huán)狀結(jié)構(gòu)。比較限制酶切DNA部分變性及全分子部分變性結(jié)果，確定酶切位點(diǎn)次序。richAT

richAT

3.末端標(biāo)識法待測DNA片段5’或3’端先用32P標(biāo)識；用某限制性內(nèi)切酶部分酶解；電泳和放射自顯影分析這一組酶解片段長度。各相鄰片段長度之差就是二個(gè)相鄰切點(diǎn)之間距離，也即它們之間片段大小。以足夠數(shù)量限制性內(nèi)切酶分別進(jìn)行分析，對DNA片段作出比較詳細(xì)物理圖譜。

GFEDCBA－

*

A-G

*

A-F

A-EA-D*

A-C

*

A-B

*

A

*

＋

末端標(biāo)識

*電泳凝膠上DNA片斷判定人類部分染色體物理圖譜TheE.coligenome五、核酸序列分析DNA一級結(jié)構(gòu)測定

（DNAsequencing）

DNA一級結(jié)構(gòu):

多聚脫氧核苷酸鏈中脫氧核苷酸排列次序——堿基序列DNA堿基次序測定主要方法

1975年，Sanger加減法1977年，Sanger雙脫氧終止法1977年，Maxam&Gilbert化學(xué)斷裂法1.雙脫氧法(dideoxymethod)或末端終止法(chaintermination)DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.Sanger,F.,Nicklen,S.&Coulson,A.R.(1977).

ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA,74,5463-7.asecondNobelPrizeinChemistryin1980DNA生物合成參加DNA復(fù)制主要物質(zhì)底物:

dATP,dGTP,dCTP,dTTP（dNTP）聚合酶:

DNA聚合酶（DNApolymerase）模板（template）:

解開成單鏈DNA母鏈引物（primer）:

互補(bǔ)于模板鏈寡核苷酸片段，

提供3-OH末端使dNTP能夠依次聚合子鏈DNA延長方向:5’→3’DNA生物合成過程DNA聚合酶催化反應(yīng)雙脫氧核苷酸雙脫氧核苷酸摻入終止DNA鏈合成測序體系*****(1-5%)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測*****+–變性聚丙烯酰胺凝膠電泳丙烯酰胺+雙丙烯酰胺→三維網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu)變性劑:尿素電泳裝置放射自顯影利用放射性同位素所發(fā)射出來帶電粒子(α或β粒子)作用于感光材料鹵化銀晶體，從而產(chǎn)生潛影，這種潛影可用顯影液顯示，成為可見"像"。

2.自動(dòng)測序HooddevelopedaprototypeautomatedDNAsequencerin1985Leroy

Hood(1938---)earnedanM.D.FromJohnsHopkinsUniversityin1964andaPh.D.inbiochemistryfromtheCaliforniaInstituteofTechnologyin1968.HewontheLemelson-MITPrizeforinventingfourinstruments:theDNAgenesequenceandsynthesizer,andtheproteinsynthesizerandsequencer

熒光物質(zhì)作為標(biāo)識物CCGAATGCTGACGTA熒光物質(zhì)標(biāo)識雙脫氧核苷酸t(yī)heSangerInstituteTeam55:SequencingFacility3.堿基序列測定新方法("Nextgeneration"methods)美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）設(shè)置“RevolutionaryGenomeSequencingTechnologies”基金，目標(biāo):20，測定一人全基因組序列只$10萬，年，費(fèi)用將降為$1000。Waston5月31日獲贈(zèng)裝有他本人完整基因組圖譜數(shù)據(jù)DVD光盤。（2個(gè)月，$200萬）基因組學(xué)先鋒J.CraigVenter、炎黃一號‘第一個(gè)中國人基因組圖譜先后完成2008，首張非