真菌的實驗診斷胡主任

關于真菌的實驗診斷胡主任1第1頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五2真菌感染的危險因素：中心靜脈插管 尿道插管廣譜抗生素氣管插管腹部外科腸胃外營養(yǎng)營養(yǎng)不良住院時間感染之前定殖第2頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五3醫(yī)學重要的酵母菌分類SegalB,BowEJ,MenichettiF:InfectDisClinNAm2002;16:935-64

條件致病的酵母菌

念珠菌屬

非念珠菌屬白念珠菌

非白念珠菌熱帶念珠菌近平滑念珠菌光滑念珠菌克柔念珠菌季也蒙念珠菌葡萄牙念珠菌

隱球菌屬新型隱球菌

毛孢子菌屬白吉利毛孢子菌頭狀毛孢子菌

酵母屬釀酒酵母

紅酵母屬第3頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五4

霉菌

曲霉菌屬

非曲霉菌屬煙曲霉非煙曲霉

黃曲霉黑曲霉土曲霉

鐮刀霉 茄病鐮刀霉 尖孢鐮刀霉

賽多孢屬

尖端賽多孢 多育賽多孢

接合菌

根霉屬 毛霉屬 根毛霉屬 梨頭霉屬 小克銀漢霉屬

暗色孢霉

鏈格孢霉屬

萬氏霉屬

雙極菌屬

彎孢屬醫(yī)學重要的霉菌分類SegalB,BowEJ,MenichettiF:InfectDisClinNAm2002;16:935-64第4頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五5診斷方法影像學組織病理學/細胞學培養(yǎng)血清學分子生物學方法：

PlateliaAspergillusELISAFungitellassayPCR（unavailable）傳統(tǒng)的方法第5頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五6

TimeAxisofMethodsforDetectionofPulmonaryAspergillosisCTpositive

123456789101112131415chestX-rayantigen?-glucanculturehistologyPCRKamiMetal,ClinInfectDis2001;33:1504-12第6頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五7真菌病實驗室診斷主要內容準確、快速檢出真菌病原體真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理生理生化血清學方法分子生物學第7頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五8真菌感染的診斷直接涂片真菌培養(yǎng)組織病理＋真菌培養(yǎng)是“金標準”第8頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五9有意義的真菌培養(yǎng)標本非經(jīng)口痰標本非插管尿標本血液或其他無菌體液(膽汁、胸腹水、腦脊液）第9頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五10直接鏡檢的浮載液和染色劑KOH-10~20%-皮膚標本Gramstain-真菌均為陽性Calcofluorwhite-熒光染色India-ink-墨汁染色LPCB-乳酸酚棉藍Immunofluorescence-免疫熒光第10頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五11直接鏡檢對痰、竇道排泄物及氣管沖洗液等標本直接鏡檢可以看到透明分支的菌絲、膿血或痰太粘稠用10％KOH處理后再進行鏡檢如果曲霉菌寄生與空氣相通的器官中，鏡檢甚至可以看到曲霉頭菌絲有隔，呈二叉型，45℃分枝。第11頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五12菌絲和孢子第12頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五13直接鏡檢——酵母細胞第13頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五14隱球菌病—直接鏡檢（墨汁染色）第14頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五15有意義的涂片結果機體內部標本如血液、腹水、CSF、膿腫穿刺液等新鮮尿液見到大量菌絲及孢子口腔、陰道、支氣管灌洗液見到酵母樣菌應作培養(yǎng)確定第15頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五16多細胞真菌形態(tài)sporehypha第16頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五17真菌培養(yǎng)第17頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五18真菌培養(yǎng)檢查目的—提高病原體檢出的陽性率，確定致病菌的種類。意義——發(fā)現(xiàn)肯定的致病原如新生隱球菌時，診斷即可確立。

—分離出條件致病菌如白念珠菌或煙曲霉，應結合臨床情況進行判斷。

—無菌部位如血液或腦脊液中分離出條件致病菌常提示肯定的感染，但對來自于膿、痰或尿的標本則應謹慎解釋結果。但任何一株培養(yǎng)物都不應輕易視為污染菌。需結合直接鏡檢的結果，強調直接鏡檢與培養(yǎng)檢查相結合的重要性。強調臨床醫(yī)師與實驗室檢驗人員之間的相互聯(lián)系。第18頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五19092第19頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五20區(qū)分酵母樣或霉樣菌落第20頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五21Aspergillusfumigatus-ColonialMorphology,Sabouraud葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基煙曲霉菌第21頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五22Aspergillusfumigatus-MicroscopicMorphology,100xLactophenolcottonblue(單列)分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、瓶梗、分生孢子第22頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五23Aspergillusflavus-在Sabouraud葡萄糖瓊脂黃曲霉菌生長快黃色表面粉末狀第23頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五24Aspergillusflavus-MicroscopicMorphology,100xLactophenolcottonblue黃曲霉菌(二列為主)分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、瓶梗、梗基、分生孢子第24頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五25Penicilliumspecies-ColonialMorphology,Sabouraudagar青霉屬氣生菌絲密毯狀第25頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五26Penicilliumspecies-MicroscopicMorphology,400xLactophenolcottonblue青霉屬(帚狀枝,分生孢子)第26頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五27Aspergillusniger-ColonialMorphology,Sabouraudagar黑曲霉菌(背面)第27頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五28Aspergillusniger-MicroscopicMorphology,100xLactophenolcottonblue(二列為主)分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、瓶梗、梗基、分生孢子第28頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五29真菌體外藥敏試驗第29頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五30真菌體外藥敏試驗1K-B法2MIC法3E-test法第30頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五31液基稀釋法

CLSIM27A2：致病性酵母菌

CLSIM38A：產(chǎn)孢絲狀真菌瓊脂稀釋法紙片擴散法——CLSIM44-AE－test法抗真菌藥物體外敏感試驗第31頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五32第32頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五33E-test法：可用于酵母樣真菌和絲狀真菌第33頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五34096第34頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五35白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第35頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五36白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第36頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五37白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第37頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五38白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第38頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五39白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第39頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五40白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第40頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五41體外抗真菌藥敏試驗與體內療效90-60原則—MIC值與臨床療效

藥敏試驗敏感菌株：90%對治療有效藥敏試驗耐藥菌株：60%對治療有效

MahmoudA.G,JCM1996,34:489-495；RexJ,CID2002,35:982-989第41頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五42

真菌特異性抗原的免疫學檢測

1(1-3)-?-D-葡聚糖

2半乳甘露聚糖

3甘露聚糖

4D-阿拉伯糖醇

5烯醇化酶

6新生隱球菌莢膜抗原第42頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五43(1-3)-?-D-Glucan(葡聚糖)“G”試驗第43頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五44(1-3)--D-Glucan生物活性(1-3)--D-Glucan作為真菌細胞壁成分之一，一旦進入機體后，將引起真菌病，嚴重時將會引起嚴重的深部真菌感染疾病，因此,深部真菌感染對患者的健康與生命構成嚴重威脅.傳統(tǒng)檢測方法為真菌培養(yǎng)，一是周期長，二是陽性率特別低．主要是抗生素類藥物的濫用所引起．真菌感染出現(xiàn)逐漸上升趨勢．第44頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五45“G”試驗緣何而來？第45頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五46比濁法反應機理

細菌內毒素 （1-3）-D-Glucan LAL-RM(反應物)因子C 活化因子C

因子B 活化因子B活化因子G

因子G

凝固酶原 凝固酶

凝固蛋白原 凝固蛋白（凝膠）定量濁度儀 TurbidimetrictechniqueGEL第46頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五47G試驗1-3-β-D-Glucan葡聚糖存在于念珠菌、曲霉等的細胞壁中，能特異性激活G因子，從而激活鱟試驗，此過程稱為G試驗?？谘什磕钪榫試驗結果陰性隱球菌,毛霉菌感染G試驗假陰性第47頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五48(1→3)-β-D-葡聚糖檢測是酵母菌及絲狀真菌細胞壁上的一種成分內毒素檢測方法應用范圍：曲霉菌、念珠菌、鐮刀霉、毛孢子菌、酵母菌、足分支菌隱球菌、毛霉菌除外已在美國FDA以及一些歐洲國家得到批準

第48頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五49(1→3)-β-D-葡聚糖檢測美國主要針對念珠菌血癥進行了研究需要更多有關其它感染的研究信息（侵襲性曲霉菌?。]有真菌感染的患者血液中也會出現(xiàn)β-D-葡聚糖：-血液透析-使用血制品（白蛋白、丙球）-使用含有葡聚糖的紗布臨床上陽性結果出現(xiàn)較晚使用某種抗生素是否會導致假陽性？

第49頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五50G試驗商品化試劑盒detectsinonehour1天津濱海新區(qū)金山川公司生產(chǎn)產(chǎn)品

2Fungitec-Gglucan(Seikagaku)Obayashi1992cutoff：

20pg/ml3FungitellTMAssay(AssociatesofCAPECOD)cutoff：80pg/ml第50頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五511輸注白蛋白或球蛋白2血液透析(纖維素濾膜）3輸注抗腫瘤多糖類藥物4使用磺胺類藥物5外科手術后早期6標本接觸紗布G試驗假陽性問題第51頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五52酵母菌、絲狀真菌細胞壁成分不僅檢測曲霉菌，還可以檢測念珠菌、鐮刀菌、毛孢子菌、支頂孢屬不能檢測：隱球菌和接合菌美國FDA已批準，歐洲部分國家已注冊敏感性、特異性：90％左右－D－葡聚糖的價值第52頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五53－D－葡聚糖（G試驗）的缺陷標本采集不能鑒定何種真菌感染第53頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五54－D－葡聚糖參考值健康人：<10pg/ml

可疑感染：10~20pg/ml深部真菌感染：>20pg/ml第54頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五55ThecutoffofGtestCutoff(pg/ml)Sensitivity(%)Specificity(%)6069.987.18064.492.4ClinicalInfectiousDiseases2005;41:654-9ThecutoffofGtest第55頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五56曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）第56頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五57曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）Figure1-10Noncompetitivesandwichmethodofimmunoassay第57頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五58曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）曲霉菌細胞壁上一種多聚糖抗原可以從血清、腦脊、胸水、BALF檢測到方法：ELISA（BioRad）：敏感性高1ng/mlLatexagglutination：15ng/ml第58頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五59影響GM檢測的因素宿主曲霉菌疾病譜高?；颊叩闹委烥M的其它來源GM的循環(huán)動力學抗GM抗體真菌曲霉菌種類？營養(yǎng)情況GM釋放的動力學？策略采樣頻率標本種類陽性定義試驗設計方法Cut-off方法/實驗室內差異手工vs自動化第59頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五60GM試驗假陽性問題以乳或乳制品為主食的嬰幼兒異體骨髓移植患者菌血癥患者自身抗體陽性患者使用半合成青霉素第60頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五61GM與β內酰胺類抗生素GM與哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、青霉素V有交叉反應錯誤地提高了診斷的確定性

第61頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五62合適的判定折點：1.0,0.7,0.5?在兒童的應用價值？食物中的GM可以被吸收，假陽性？哌拉西林/他唑巴坦治療，假陽性？非血液病患者應用不多抗真菌治療對結果的影響？半乳甘露聚糖(GM)檢測存在的問題第62頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五63兩種試驗敏感性、特異性相當都可以在早期診斷侵襲性曲霉病，但是－D－葡聚糖可能出現(xiàn)更早兩者結合，可以互補彌補GM假陰性可能同樣在粒細胞缺乏患者用的多，其他患者有待研究半乳甘露聚糖(GM)與－D－葡聚糖的比較第63頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五64血清抗體檢測由于患者存在免疫受損，抗原遞呈功能和及淋巴細胞功能受損，不能產(chǎn)生足夠的抗體。診斷價值較低。第64頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五65系統(tǒng)性真菌感染診斷的進展第65頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五66檢測真菌的特異性酶白念—N-乙酰-D半乳糖苷酶白念—脯氨酸按肽酶都柏林念珠菌N-乙酰-D半乳糖苷酶克柔酸性磷酸酶熱帶吡烙磷酸酶平滑-D半乳糖苷酶新生隱球菌酚氧酶第66頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五67PCR

通過擴增曲霉菌特異基因片斷，達到快速診斷的目的，但容易污染。第67頁，共75頁，2022年，5月20日，17點21分，星期五68PCR診斷侵襲性真菌病一種可能的全真菌檢測方法可能用來進行血清學篩查（早期診斷）方法和標本不同，敏感性及特異性不同底線：有診斷潛能，但還不是最佳的方法

AlexanderB,TransplInfectDis,2002,(supply3):32