溫度敏感突變株的分離課件

溫度敏感突變株的分離生工（2）班第一小組定義:在誘變處理后的群體中能分離到這樣一類突變株:它們在許可的溫度下能正常生長，其表型和野生型沒有區(qū)別，在非許可溫度條件下不能生長或微弱生長，表型與野生型不同，這種條件致死突變株即溫度敏感突變株溫敏突變株的特性TS突變株主要由必需基因的突變導(dǎo)致某些基因產(chǎn)物（某種酶）的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而引起的，即突變體的酶蛋白一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列發(fā)生了改變，而酶的活性中心并未發(fā)生改變。有時非必需基因的突變也可產(chǎn)生溫敏突變株。溫敏突變株的突變位置，就谷氨酸而言，據(jù)推測，發(fā)生在與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細胞膜結(jié)構(gòu)基因上。這種基因突變，最常見的事錯義突變，主要是結(jié)構(gòu)上的堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換引起氨基酸序列的改變。其次，還有二次移碼突變、結(jié)構(gòu)基因末端缺失突變等。溫敏突變株的篩選方法（1）溫敏突變株的誘發(fā)（2）富集（3）分離篩選（二）富集TS突變株的出現(xiàn)頻率極低，僅有0.1%左右。為了提高篩選概率，誘變后的菌懸液先要進行富集。富集方法有抗生素法、物理方法、H3-前體法等。1.抗生素法這是常用的方法，其原理與營養(yǎng)缺陷型抗生素濃縮法相同。細菌類采用青霉素法,真菌類采用制霉菌素法。方法是：將誘變后的菌體在非許可溫度下，培養(yǎng)一定時間后，加入抗菌素，此時可殺死或殺傷在該溫度下生長的野生菌，不可能殺死在同樣溫度條件下未曾生長的TS突變株，離心去除抗生素，進行分離。2.過濾或離心法某些TS突變株是DNA復(fù)制缺損或孢子萌發(fā)缺損的突變株，它們在非許可溫度下培養(yǎng)到一定時期，細胞伸長成絲狀，或芽枝不脫離母細胞，致使比重增加，因而可用薄膜過濾或密度梯度離心等方法富集達到與野生菌株分開的目的。3.H3-前體法如果要富集某種大分子合成缺損的TS突變株，可以加入相應(yīng)的H3-前體物質(zhì)即可達到目的。（三）分離篩選菌體經(jīng)過富集以后，可以制成一定的稀釋度，分離于平板。TS突變株的篩選方法比較簡單，主要根據(jù)菌體在高于或低于最適生長溫度5—15℃的生長狀態(tài)。各類微生物突變株的溫度范圍大約為：細菌為30—40℃（30℃為許可溫度，40℃為非許可溫度，下同）。放線菌為30—38℃，酵母菌為23—36℃?？捎贸Ｒ?guī)法和特殊法進行篩選。1.常規(guī)法2.特殊分離篩選方法分離篩選的方法經(jīng)過富集后的菌體細胞分離在完全培養(yǎng)基上，置于許可溫度下培養(yǎng)，當(dāng)長出菌落之后，用平板影印法（見圖6.17）將菌落分別復(fù)印到一個完全培養(yǎng)基上和兩個基本培養(yǎng)基各一皿，置于非許可溫度下培養(yǎng)，另一組取完全培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基各一皿，置于非許可溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)后根據(jù)菌落生長情況，可以分為兩大類：1.常規(guī)法一類是非必需基因突變形成的溫敏突變株，在許可溫度下的基本培養(yǎng)基上生長，說明該類突變株從完全培養(yǎng)基中補充了某種生長因子后才得以生長，是一類突變引起失去單一酶但可以補償功能的TS突變株。另一類是由必需基因突變引起的TS突變株，在許可溫度的基本培養(yǎng)基上生長，而非許可溫度的基本培養(yǎng)基上都不生長，說明該類突變株即使從完全培養(yǎng)基內(nèi)提供了某種生長因子也無法補償失去的功能。通常TS突變株是指后一類。假如在許可與非許可溫度下基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上全部生長，則為野生菌株。將誘變處理后的菌體直接涂布于，先在非許可溫度下培養(yǎng)，長出菌落作記號，即為野生型菌株，然后再置于許可溫度下培養(yǎng)，長出新的菌落，即為TS突變株。通過以上方法檢出的TS突變株要進一步復(fù)征，然后純化。2.特殊分離篩選方法

如要具體獲得具有特定性能TS突變株，要靈活巧妙的設(shè)計富集方法和平板培養(yǎng)基組成。例如:1要獲得由甲醇和甘氨酸合成高產(chǎn)的絲氨酸菌株，先通過誘變因子處理，從中篩選出絲氨酸降解代謝障礙的TS突變株，但要排除C4二羧酸分解代謝障礙TS突變株。為此，Moringga先用甲醇為碳源，篩選得到有關(guān)的TS突變株，然后從中進一步篩選絲氨酸突變菌株，即把以上溫敏突變株移接到含有琥珀酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，淘汰在琥珀酸上生長良好的突變株，以提高篩選效率。

2造成單細胞蛋白質(zhì)中蛋氨酸含量高的TS突變株的主要原因：第一是遺傳密碼翻譯期間發(fā)生錯誤的內(nèi)在因素；第二是高溫引起堿基錯配的外界因素。因此，篩選這種突變株時，可以在分離培養(yǎng)基中增加蛋氨酸的濃度，增加錯誤轉(zhuǎn)譯機會。

具體方法:把菌體涂布于基本培養(yǎng)基上，限置于許可溫度下培養(yǎng)，而后在轉(zhuǎn)移到0.2%蛋氨酸的基本培養(yǎng)基上,放置于非許可溫度下培養(yǎng)