微生物學(xué)通報(bào)

微生物學(xué)通報(bào)微生物學(xué)通報(bào)微生物學(xué)通報(bào)V:1.0精細(xì)整理，僅供參考微生物學(xué)通報(bào)日期：20xx年X月離子束照射誘變技術(shù)構(gòu)建生物乙醇高產(chǎn)酵母菌株楊浩趙更峰王麗王林嵩(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院河南新鄉(xiāng)453007)摘要:利用原生質(zhì)體融合、離子束照射誘變等技術(shù)構(gòu)建生物乙醇高產(chǎn)酵母菌株。在35%聚乙二醇(PEG)的作用下將釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母融合，通過不同劑量的氮離子束照射融合子，篩選出能夠穩(wěn)定遺傳的子代菌株。誘變后的菌株其酒精產(chǎn)率提高了40%，同時(shí)木糖利用率也有所提高。采用不同劑量的氮離子束對(duì)融合后的菌株照射能較大幅度的提高菌株的變異幾率，從而能減少篩選理想菌株的時(shí)間和工作量。關(guān)鍵詞:釀酒酵母，管囊酵母，原生質(zhì)體融合，離子束Ahighproductionofbio-ethanolmicrozymebyionradiatingmutagenesisYANGHaoZHAOGeng-FengWANGLiWANGLin-Song(CollegeofLifeScience,HenanNormalUniversity,xinxiang,Henan453007,China)Abstract:Ahighproductionofbio-ethanolmicrozymebyionradiatingmutagenesisandprotoplastfusionIneffectforthe35%PEGtomakepachysolentannophandsaccharomycescerevisiaeprotoplastfusion.ThroughdifferentradiatedosisofN+,filteroutthegenerationofthemicrozymethatcouldinheritthecharacteristic.Theproductivityimprove40%,andthexyloseutilizationratealsoimproved.WithdifferentdosisofN+radiatetheprotoplast，theprotoplastcouldhaveahighprobabilitytoaberrance,andissueinreducetheworksandtimeforfilterthedesirablemicrozyme.Keywords:Saccharomycescerevisiae,Pachysolentannophilus,Intergenericprotoplastfusion,Ionbeam.木糖是木制纖維素中大量存在的一種無碳糖，是自然界最豐富的糖類之一，對(duì)它的生物轉(zhuǎn)化具有重要的經(jīng)濟(jì)意義1,2。釀酒酵母?jìng)鹘y(tǒng)地被釀酒工業(yè)應(yīng)用于從六碳糖生產(chǎn)酒精，并作為宿主菌生產(chǎn)多種外源蛋白3,4。釀酒酵母具有木酮糖磷酸化酶，能利用木酮糖，但缺乏代謝木糖的能力5。本研究利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母相融合6～9，擴(kuò)大其基因交流和重組的范圍，獲得既能有效利用木糖、又能發(fā)酵產(chǎn)酒精的酵母。并在此基礎(chǔ)上用氮離子束誘變提高其酒精產(chǎn)率，為植物纖維水解產(chǎn)物的利用打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌株釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。1.2培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基:YEPD培養(yǎng)基10;固體完全培養(yǎng)基:在YEPD中添加20g/L瓊脂;KCl高滲再生培養(yǎng)基:在YEPD中加入0.8mol/L的KCl。(以上培養(yǎng)基均在121℃滅菌20min處理);TTC上層培養(yǎng)基:TTC(2,3,4-三苯基氯化四氮唑)0.5g/L(過濾滅菌),葡萄糖5g/L，瓊脂15g/L(高溫滅菌);木糖發(fā)酵培養(yǎng)基121.3試劑磷酸緩沖液(PB)13:PH=5.8;高滲磷酸緩沖液(PBS):PB中加入0.8mol/LKCl;酶液：蝸牛酶、纖維素酶用高滲磷酸緩沖液(PBS)配制，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾滅菌11;促融合劑:35%PEG(MW4000)，內(nèi)含0.01mol/LCaCl2(過濾滅菌)14以上試劑除酶以外均經(jīng)過121℃高溫滅菌20min。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1菌體篩選將釀酒酵母接種至固體完全培養(yǎng)基中27℃培養(yǎng)，而后利用TTC上層培養(yǎng)基挑選顏色較深的菌落，經(jīng)比較選出酒精產(chǎn)率較高的菌株。1.4.2制備原生質(zhì)體將活化的菌種接種至液體完全培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，用2%的蝸牛酶和2%纖維素酶混合酶30℃輕微振蕩處理，每15min定時(shí)取樣鏡檢，待視野中90%左右細(xì)胞變成原生質(zhì)體后停止酶解，離心去酶液，加入高滲緩沖液備用。1.4.3原生質(zhì)體融合將釀酒酵母的原生質(zhì)體用紫外線30cm處照射60s滅活，嗜鞣管囊酵母原生質(zhì)體在水浴65℃70min滅活處理，然后置于35%PEG中于40℃處理40min。將反應(yīng)后的菌液離心并涂布在固體再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長出菌落后用TTC上層培養(yǎng)基挑出顏色比較深的融合子，篩選產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)的菌株。1.4.4離子束誘變?cè)陔x子束照射前，將篩選好的菌株用保護(hù)劑處理。照射時(shí)間與劑量如下:表1照射劑量和處理時(shí)間Table1DosisofradiateandprocessingtimeDosis/×1014eV2351020305080Processingtime/s12.118.232641281923205122結(jié)果2.1親本釀酒酵母產(chǎn)酒精能力的測(cè)定從十株釀酒酵母中通過重鉻酸鉀法15測(cè)定篩選三株產(chǎn)酒精能力比較強(qiáng)的菌株作為融合親本菌株。其酒精產(chǎn)率分別達(dá)到6.17mg/ml、6.62mg/ml、5.97mg/ml。2.2親本管囊酵母的木糖利用率的測(cè)定用15g/L的木糖發(fā)酵培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)嗜鞣管囊酵母，用DNS法(3,5-二硝基水楊酸法)測(cè)定發(fā)酵液中還原糖含量，殘?zhí)菨舛葹?.45g/L,其木糖利用率為90.3%。2.3融合子產(chǎn)酒精能力和木糖利用率的測(cè)定融合子經(jīng)過TTC反應(yīng)，篩選出若干株酒精產(chǎn)率比較高的融合子(通過顏色判定)，測(cè)定其木糖的利用情況。篩選出一木糖利用率最高的菌株，經(jīng)過木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，殘?zhí)菨舛葹?.27g/L，其木糖利用率為91.53%，酒精度為6.45mg/ml。2.4離子束誘變后菌株的產(chǎn)酒精能力和木糖利用率的測(cè)定該菌株進(jìn)行不同劑量的離子束照射后，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)，用計(jì)量為3×1015eV照射過的菌株酒精產(chǎn)率增幅最大，酒精產(chǎn)率由原來的6.45mg/ml上升到9.01mg/ml，殘留木糖濃度為0.23g/L，利用率達(dá)到98.4%。3討論當(dāng)前，離子束技術(shù)已廣泛應(yīng)用于微生物誘變16。在本實(shí)驗(yàn)中，利用氮離子對(duì)融合子進(jìn)行誘變照射，成功誘變出比母本酒精產(chǎn)率不同程度提高的酵母菌株。而且，得到的新菌株對(duì)木糖的利用率比母本有所提高。單一的通過原生質(zhì)體融合能使兩種酵母菌的基因雜交，擴(kuò)大基因的交流范圍，在這過程中產(chǎn)生突變的幾率很小，融合后新菌株的各項(xiàng)指標(biāo)都維持在親本菌株的水平；而單一的通過離子束照射誘變能大幅增加基因的突變幾率，但是要誘變出有理想性狀的菌株則需大量的親本菌株和大量的篩選工作17。相對(duì)于以上兩種方法，采用先通過細(xì)胞融合篩選出含有親本性狀的菌株，再通過離子束誘變含有兩親本基因的菌株能夠大大的提高誘變出理想型菌株的幾率，同時(shí)減少菌株篩選的時(shí)間和工作量。通過以往相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，通過外界的離子注入與生物體相互作用，只要實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中含有氮元素參與，不管氮元素是來自外界還是生物體本身含有的，都有一定的幾率形成氨基或氨基酸18，這種新的氨基酸分子的合成可能對(duì)DNA的產(chǎn)生和基因調(diào)控序列產(chǎn)生影響；即使離子注入沒有使菌株結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，調(diào)控序列的修飾同樣可以導(dǎo)致菌株遺傳性突變。實(shí)驗(yàn)選擇氮離子注入可以在相對(duì)溫和的情況下獲得目的菌株。采用氮離子照射時(shí)，在劑量為2×1014eV～8×1014eV范圍內(nèi)產(chǎn)生HRS/IRR效應(yīng)。然而當(dāng)劑量增加到3×1015eV～8×1015eV時(shí)，菌株的存活率顯著提高，表明該菌株隨著劑量的提高抗性也有所增強(qiáng)，這一現(xiàn)象與其他微生物的研究成果有所差別，原因有待進(jìn)一步研究19。若HRS/IRR效應(yīng)損傷嚴(yán)重而得不到修復(fù)則導(dǎo)致細(xì)胞死亡；若損傷得到修復(fù)且修復(fù)正確，則獲得突變菌株的幾率下降；所以在細(xì)胞存活率低時(shí)易于得到突變菌株。參考文獻(xiàn)[1]OlssonL,Hahn-agerdalB.Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction[J].EnzymeMicrobialTechnol.1996,18:312-331[2]AlexanderMA,ChapmanTW,JefferiesTW.ContinuousethanolprodutionfromD-xylosebyCandidashehatae[J].biotechnol.bioeng.1987,30:685-691.[3]BarnettJA.In:TipsonRS,HortonD(eds),AdvancesinCarbohydrateChemistryandBiochemistry.NewYork:AcdemicPress,1976,pp125～235.[4]JillEOgden.In:PeberdyJF(eds).AppliedMolecularGeneticsofFungi,CambridgeUniversityPress,1991,pp.66～84.[5]Hahn-hagerdalB,NhallomJ,JeppsonHetal.In:SaddlerJN(ed.),CABInternational,Wallingford,UnitedKingdom,1993,pp.231～290.[6]Morgan,A.J.:Inporotoplasts1983,editedbyPotrykusIetal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