單鏈絲狀噬菌體載體

第四節(jié)單鏈絲狀噬菌體載體一、M13噬菌體的生物學(xué)M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)M13噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長和分裂。M13噬菌體的基因組為單鏈DNA，由6407的堿基組成（GenBank注冊號為V00604）?；蚪M90%以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有11個編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個堿基。較大的間隔位于基因W和基因I以及基因II和基因W之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和DNA合成的元件。M13噬菌體基因組可編碼3類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（基因II，V和X），形態(tài)發(fā)生蛋白（基因I，W和XI），結(jié)構(gòu)蛋白（基因I、丑、W、W和X）。所有結(jié)構(gòu)蛋白在形態(tài)發(fā)生之前都插入在宿主細(xì)胞的質(zhì)膜中?；蚪MDNA為正鏈，按基因II至基因W方向合成，與噬菌體的mRNA序列同義。圖3-20是M13噬菌體的遺傳圖譜。圖3-21：ML3噬菌體的遺傳圖譜圖^21=M13箜菌榭粒結(jié)構(gòu)倒1M13噬菌體顆粒為絲狀長管狀結(jié)構(gòu)，長880nm,直徑6-7nm。噬菌體顆粒的核心由2700個基因W編碼的結(jié)構(gòu)蛋白呈管狀排列而成（圖5-32），成熟的基因W的產(chǎn)物為由50個氨基酸殘基組成的a螺旋蛋白。頂端由5個基因W和5個基因IX產(chǎn)物組成，作用于間隔區(qū)中的包裝信號。5個基因III蛋白和5個基因丑蛋白位于絲桿的末端，參與對性纖毛的吸咐。圖3-21是M13噬菌體結(jié)構(gòu)模型。M13噬菌體的增殖吸附是噬菌體感染的第一步，M13噬菌體只感染具有性纖毛的菌株，攜帶F質(zhì)粒的菌株可產(chǎn)生性纖毛。在吸附過程中，噬菌體的基因III蛋白與性纖毛發(fā)生作用。隨后絲狀噬菌體穿入到性纖毛，基因III蛋白與宿主的TolQ、TolR和TolA蛋白發(fā)生作用，去除外殼蛋白，致使病毒DNA及附著于其上的基因I蛋白進入宿主菌體內(nèi)。

,Eg*叫sHng^-slFandMlcircularDNAisconvertadlodOLHya-slrandMlnepliealtnglcwm〈Af|&NAbyIwat-ariGodedenrymea.SeveralroondsnirepiicslionoccurIhrcMflhNslruclkMes.Tha(TstrandoflheRFDMAblwsenbedintovir-almHNAsThe炳W期Ig娜*II具rWuc-inimHuc屈&片F(xiàn)IfCR削由山此虹Iis^rndMraw)anthi9(■*■)slrandofRFEl^JAProgeny(■*)BtrandrBsyrtli&siz&dtinuausly坷酣口爐tmoniof［瞄r^piicatiCMimiichiiwryJirouiMithe(-59-UandIraningcirclerepiicalj&n：i.Tho-compleCeciprogeny4*IslrsndiscJeavedfromtherollingcircularHrueiurebyihoviralgmneIIproduct>|nedarrnw^.TheproQenyslrandl^noinsufaci莘■瓦SQ^ny(+)strandemtinues.圖3-22=ML3噬菌儺在感染細(xì)胞中的復(fù)制在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删wDNA(正鏈)在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈DNA，用于DNA的復(fù)制，因此這種雙鏈DNA稱為復(fù)制型DNA(replicativeformDNA)，即RFDNA。通過。復(fù)制方式，RFDNA進行擴增，基因的轉(zhuǎn)錄也隨即開始?；蚪M中的任意一個啟動子都可以啟動基因的轉(zhuǎn)錄，單方向地終止于下游的終止子。啟動子和終止子的位置關(guān)系使得靠近終止子的基因轉(zhuǎn)錄更頻繁。M13噬菌體在感染細(xì)胞中的復(fù)制見圖3-22。當(dāng)基因II蛋白在親代RFDNA的正鏈特定位點上產(chǎn)生一個切口時，便啟動噬菌體基因組進行滾環(huán)復(fù)制。此時，在大腸桿菌的DNA聚合酶I的作用下，以負(fù)鏈為模板在切口的3'末端加入核苷酸，并持續(xù)DNA的合成，用新合成的DNA替換原有的正鏈。當(dāng)復(fù)制叉環(huán)繞模板整整一周時，被取代的正鏈由基因II產(chǎn)物切去，經(jīng)環(huán)化后形成單位長度的噬菌體基因組DNA。在感染開始的15?20分鐘內(nèi)，這些子代正鏈在宿主細(xì)胞酶的作用下，又轉(zhuǎn)變成RFDNA，然后以之為模板繼續(xù)轉(zhuǎn)錄并繼續(xù)合成子代正鏈DNA。當(dāng)感染細(xì)胞內(nèi)累計有100-200個RFDNA時，細(xì)胞內(nèi)也產(chǎn)生了足夠的單鏈DNA結(jié)合蛋白，即基因V蛋白。該蛋白可以抑制翻譯活性，特別是抑制基因IImRNA的翻譯，并且強烈地結(jié)合在新合成的正鏈DNA上，阻止其轉(zhuǎn)化成RFDNA。此時，DNA的合成幾乎只產(chǎn)生子代正鏈DNA。另外，基因X蛋白和基因V蛋白也是噬菌體特異DNA合成的強力抑制子，從而限制感染細(xì)胞內(nèi)RFDNA的數(shù)量。結(jié)果，感染細(xì)胞內(nèi)RFDNA的數(shù)目和子代正鏈DNA的產(chǎn)生速率都能保持適度。成熟噬菌體顆粒由11個病毒蛋白中的5個組成，至少4個其他蛋白(如基因I、W和XI蛋白，以及宿主的硫氧還蛋白(thioredoxin)對噬菌體顆粒的組裝和分泌是必須的。二、M13噬菌體載體單鏈DNA的酶切和連接是比較困難的，因此M13噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈狀態(tài)的RFDNA。RFDNA很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。載體的插入位點在M13噬菌體基因組中絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個間隔區(qū)可用來插入外源DNA（基因II/W和基因W/m之間）。基因II和基因W之間的508bp間隔區(qū)是主要的外源片段插入位點。在基因w和基因m之間的小間隔區(qū)也可用來插入外源片段，但是在操作過程中，需要獲得感染細(xì)胞的菌落進行影印篩選，比利用可見的噬菌斑方法更慢更麻煩?；騒也可用來克隆外源片段。M13噬菌體載體組成現(xiàn)在所使用的M13噬菌體載體是Messing及其同事建立的mp系列載體，以基因II和基因W之間的區(qū)域作為外源DNA插入?yún)^(qū)。mp載體系列都是從同一個重組M13噬菌體（M13mpl）改造而來的。在M13mpl載體中，間隔區(qū)內(nèi)的Haem位點插入了一小段大腸桿菌DNA，引入a互補篩選。M13mpl8和M13mpl9M13mpl8和M13mpl9這兩個載體含有13個不同的酶切位點，可供插入由多種各不相同的限制酶切割而成的DNA片段（圖3-23）。M13mpl8和M13mpl9DNA的全序列已經(jīng)測定完成（GenBank注冊號為M77815和L08821），這兩種載體只是在lacZ區(qū)內(nèi)不對稱的多克隆區(qū)的方向上有所不同。圖3-23=M13iigil8/19的途傳圖譜當(dāng)RFDNA被兩種不同的限制酶切割以后，M13mpl8和M13mpl9輕易不能重新環(huán)化。僅當(dāng)連接混合液中含有帶匹配末端的外源雙鏈DNA片段時，方可閉合成環(huán)。這一片段在M13mpl8和M13mpl9中將以兩個互為相反的方向插入。這樣一來，在M13mpl8的正鏈中含有外源DNA雙鏈的其中一條鏈，而在M13mpl9正鏈中則含有外源DNA的另一條鏈，即M13mpl8重組體的子代噬菌體內(nèi)含有外源DNA的一條鏈，M13mpl9重組體的子代噬菌體內(nèi)則含有它的互補鏈。故用M13mpl8和M13mpl9作為一對載體，就可能用一個引物(通用引物)，從所插入DNA片段的任一端開始，測定互為相反的兩條鏈的DNA序列，并可制備只與外源DNA的任意一條鏈互補的DNA探針。三、 M13噬菌體載體的宿主菌由于M13噬菌體通過F質(zhì)粒編碼的性纖毛進入宿主細(xì)胞內(nèi)，故只能用雄性細(xì)菌來增殖病毒。Messing及其同事已經(jīng)構(gòu)建了許多攜帶F'質(zhì)粒并便于M13載體進行基因操作的多種大腸桿菌菌株，其中最重要的遺傳標(biāo)志有：lacZDMl5lacZ基因缺失突變體。D(lac-proAB)lac基因缺失突變體。lacIqlacI基因的突變體。proAB細(xì)菌染色體上脯氨酸生物合成酶類的編碼區(qū)域。traD36抑制F'因子接合轉(zhuǎn)移的突變。hsdRl7與hsdR4對大腸桿菌K株I類限制-修飾系統(tǒng)失去限制活性但仍保留修飾功能的突變體。recA1大腸桿菌重組酶基因。supE琥珀抑制基因。在M13噬菌體載體中進行克隆時常用的宿主菌株如下。JM101supED(lac-proAB)[F'traD36proAB+lacIqlacZDM15]JM105JM101/hsdR4JM107JM101/hsdR17JM109JM101/hsdR17recA1TG1JM101/hsdD5(不修飾不限制)XL1-BluesupElac-hsdR17recA1[F'proAB+lacIqlacZDM15]Tn10(Tetr)四、 絲狀噬菌體載體克隆中經(jīng)常遇到的問題在絲狀噬菌體載體的克隆中經(jīng)常遇到兩類問題。外源DNA區(qū)段的部分缺失外源DNA總是以單方向插入五、 噬菌粒噬菌粒(phagemid)實際上是帶有絲狀噬菌體大間隔區(qū)的質(zhì)粒載體，是集質(zhì)粒和絲狀噬菌體的有利特征于一身的載體，具有ColE1復(fù)制起點及抗生素抗性選擇標(biāo)記的質(zhì)粒，以及絲狀體噬菌體的間隔區(qū)。此間隔區(qū)含噬菌體DNA合成的起始與終止及噬菌體顆粒形態(tài)發(fā)生所必需的全部順式作用序列。含噬菌粒的細(xì)菌被噬菌體感染后，基因II蛋白可作用于噬菌粒的間隔區(qū)，啟動滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生ssDNA并進行包裝?？寺∮谶@些載體內(nèi)的外源DNA區(qū)段可以象質(zhì)粒一樣用常規(guī)方法進行增殖。而帶有這種質(zhì)粒的細(xì)菌被M13(或f1)絲狀噬菌體感染后，在病毒的基因II蛋白影響下，質(zhì)粒的復(fù)制方式發(fā)生改變。基因II產(chǎn)物與質(zhì)粒所攜帶的基因間隔區(qū)相互作用，啟動滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)生質(zhì)粒DNA一條鏈的拷貝，最終包裝在子代噬菌體顆粒中。PUC118和pUC119是功能比較完善的噬菌粒載體，對外源DNA片段的大小不那么敏感，并且保留了pUC質(zhì)粒在克隆操作方面的優(yōu)點（圖3-24）。在pUC18/19中增加了帶有M13噬菌體DNA合成的起始與終止以及包裝進入噬菌體顆粒所必需的順式序列（IG），當(dāng)含這些質(zhì)粒的細(xì)胞被適當(dāng)?shù)腗13絲狀噬菌體感染時，可合成質(zhì)粒DNA的其中一條鏈，并包裝在子代噬菌體顆粒中。通過純化噬菌體顆粒，可制備單鏈DNA，用于DNA序列測定、定點誘變或制備探針。噬菌粒具有以下特征：雙鏈DNA既穩(wěn)定，又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特征；免卻了將外源DNA片段從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體這一既繁瑣又費時的步驟；由于載體足夠小，故可得到長達(dá)10kb的外源DNA區(qū)段的單鏈。噬菌粒的主要優(yōu)點在于它可以產(chǎn)生大段外源DNA的適量單鏈拷貝，又不必?fù)?dān)心發(fā)生缺失突變，而這些外源DNA區(qū)段常常由于太大而不能克隆于常規(guī)M13載體。但許多噬菌粒都有一個主要缺點，即輔助噬菌體感染后，有時候單鏈DNA的產(chǎn)量較低且重復(fù)性較差。六、M13KO7輔助噬菌體M13KO7輔助噬菌體是M13的衍生株，大小為8.7kb，其結(jié)構(gòu)組成見下圖。M13KO7噬菌體帶有來自p15A質(zhì)粒的復(fù)制起點，因此可以象質(zhì)粒一樣復(fù)制，且可以與帶ColE1的質(zhì)粒共存于同一個宿主菌中。還帶有一個來自轉(zhuǎn)座子Tn903的卡那霉素抗性基因（kanr），用作選擇標(biāo)記?；騃I帶有一個G至T的突變（第6125核苷酸），導(dǎo)致基因II蛋白第40位氨基酸由甲硫氨酸變?yōu)楫惲涟彼?。輔助噬菌體M13KO7的遺傳圖譜見圖3-25。當(dāng)M13KO7感染帶有噬菌粒的大腸桿菌后，如E.coli（pUC118），進入宿主細(xì)胞內(nèi)的單鏈DNA,在宿主胞內(nèi)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式，后者可在質(zhì)粒p15A的復(fù)制起點控制下進行復(fù)制。由于細(xì)胞內(nèi)M13K07雙鏈DNA的積累并不需要病毒基因產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)的噬菌粒幾乎沒有機會干擾所進入的M13K07病毒基因組的早期復(fù)制。M1