大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)課件

皮層神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)

?主要內(nèi)容:

實(shí)驗(yàn)原理1

準(zhǔn)備工作2

實(shí)驗(yàn)步驟3

影響因素4實(shí)驗(yàn)原理◆細(xì)胞培養(yǎng)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中最常用的手段之一?？煞譃樵囵B(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種?！粼囵B(yǎng)：將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。儀器、材料與試劑無(wú)菌操作臺(tái)，培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)儀器

培養(yǎng)板，青霉素瓶，離心機(jī)，計(jì)數(shù)板冰盒，濾器（200目自制），手術(shù)器械新生鼠

DMEMF12培養(yǎng)基（20%血清），025%胰酶多聚賴(lài)氨酸，碘酒，75%酒精，PBS，阿糖胞苷

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備材料與試劑

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作培養(yǎng)板包被培養(yǎng)基，阿糖胞苷配制制備冰盒0.1%多聚賴(lài)氨酸包被胰酶消化法1準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面，紫外線消毒30分鐘。開(kāi)始工作前先洗手、75%酒精擦拭手及臺(tái)面。2布局：點(diǎn)燃酒精燈，安裝吸管帽；準(zhǔn)備離心管；

平皿及器械放置妥當(dāng)。

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)步驟布局酒精PBS冰盒PBSPBS器械剝離血管及筋膜取腦，分離皮層神經(jīng)元清洗血液斷頭剪碎組織塊3斷頭取腦：超凈臺(tái)內(nèi)，斷頭取腦，置于盛有PBS的培養(yǎng)皿內(nèi)，洗滌3次，棄除表面殘余血跡，迅速置于無(wú)菌的生理鹽水冰浴上。4剝離軟腦膜：剝離大腦皮層至預(yù)冷的PBS中，用兩把無(wú)齒彎鑷仔細(xì)剝離軟腦膜和血絲，剝離干凈后用PBS液洗2-3遍。

實(shí)驗(yàn)步驟5剪碎：將大腦皮層轉(zhuǎn)移到另一裝有PBS的平皿中，用手術(shù)剪將其剪成小塊（1mm3），用PBS液洗三次，轉(zhuǎn)移至離心管中離心1000rpm5min。6消化：加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培養(yǎng)箱消化20min,中間翻轉(zhuǎn)振蕩一次。使細(xì)胞分離。

實(shí)驗(yàn)步驟7終止消化：用含20%血清的DMEM-F12培養(yǎng)液終止消化，輕輕用吸管吹打均勻，離心1000rpm10min。8過(guò)篩網(wǎng)：棄去上清液，加入20%血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，輕輕用吸管吹打均勻，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾。

實(shí)驗(yàn)步驟9細(xì)胞計(jì)數(shù)：4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)

──────────×10４×n(稀釋倍數(shù))

4

10種板：以5×105個(gè)/ml接種于用多聚左旋賴(lài)氨酸包被過(guò)的培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)板置細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2、飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)步驟5純化：培養(yǎng)48小時(shí)全量換液，加入終濃10μmol/l阿糖胞苷的培養(yǎng)液。目的：抑制質(zhì)細(xì)胞等非神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)基材料剝膜包被消化低溫操作

影響因素材料選擇

影響因素胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆★易于操作★有一些受體，在培養(yǎng)的工作中失去功能，會(huì)不能再生影響因素培養(yǎng)基選擇不建議血清培養(yǎng)1血清刺激膠質(zhì)細(xì)胞和雜細(xì)胞分裂，影響神經(jīng)元產(chǎn)量；2抑制膠質(zhì)生長(zhǎng)，往往要加入阿糖孢苷。嚴(yán)重的毒性會(huì)影響許多靈敏實(shí)驗(yàn)；3血清培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)很不均一，從正常到凋亡都有，嚴(yán)重影響試驗(yàn)準(zhǔn)確，而無(wú)血清專(zhuān)用培養(yǎng)基所有的正常細(xì)胞都處于一樣的狀態(tài)，要么都好，要么都差，高度一致。4neurobasal和neurbasal-A被認(rèn)為是最標(biāo)準(zhǔn)，最好的培養(yǎng)基。需要的添加劑為B27和谷氨酰胺。影響因素培養(yǎng)板選擇6孔板是最佳選擇大于6孔板（比如6CMDISH）會(huì)使得中間很難和周?chē)募?xì)胞密度一樣，造成板中間和邊緣成熟度不一樣，而這會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)很大干擾。96孔或128孔：細(xì)胞會(huì)傾向于向中間集中也會(huì)照成發(fā)育不均勻影響因素重點(diǎn)剝膜吹打時(shí)候