2022年醫(yī)學專題-動物細胞工程上課ppt

事實：燒傷病人的治療通常是取燒傷病人的健康(jiànkāng)皮膚進行自體移植，但對于大面積燒傷病人來講，健康(jiànkāng)皮膚很有限，想一想如何來治療該病人？取該患者(huànzhě)的皮膚進行細胞培養(yǎng),獲得足量的細胞后再移植動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)第一頁，共四十四頁。第三節(jié)動物細胞工程(gōngchéng)及應用第二頁，共四十四頁。動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)動物(dòngwù)細胞融合單克隆抗體(kàngtǐ)制備細胞核移植動物細胞工程技術動物細胞工程的基礎第三頁，共四十四頁。1、概念(gàiniàn)

是指從動物機體內取出相關(xiāngguān)的組織，將它分散成單個細胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。2、原理(yuánlǐ)細胞增殖一、動物細胞培養(yǎng)第四頁，共四十四頁。幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織細胞培養(yǎng)胰蛋白酶處理單個細胞第五頁，共四十四頁。動物胚胎或幼齡動物的組織(zǔzhī)、器官細胞(xìbāo)懸浮液胰蛋白酶(yídànbáiméi)10代細胞原代培養(yǎng)50代細胞傳代培養(yǎng)細胞株無限傳代細胞系單個細胞加培養(yǎng)液遺傳物質未改變遺傳物質已改變動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網(wǎng)絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。第六頁，共四十四頁。細胞貼壁生長

培養(yǎng)貼附性細胞時,細胞要能貼

附于底物上才能(cáinéng)生長繁殖.第七頁，共四十四頁。細胞(xìbāo)接觸抑制

細胞(xìbāo)在貼壁生長過程中，隨著細胞(xìbāo)分裂，數(shù)量不斷增加，最后形成一個單層，此時細胞(xìbāo)間相互接觸，細胞(xìbāo)分裂和生長停止，數(shù)量不再增加。第八頁，共四十四頁。有關(yǒuguān)概念原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。一般培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(yǐnèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)(jìxù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。第九頁，共四十四頁。有關(yǒuguān)概念

細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到40~50代，這種傳代細胞為細胞株。

細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。

細胞株和細胞系的區(qū)別：

細胞系的遺傳物質改變，具有癌細胞的特點，失去(shīqù)接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。第十頁，共四十四頁。1、動物細胞培養(yǎng)液的主要成分(chéngfèn)是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？2、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物(lǜsèzhíwù)組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？主要(zhǔyào)成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基

2、成分中有動物血清等不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體思考題：第十一頁，共四十四頁。3、為什么選用動物(dòngwù)胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？4、為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散(fēnsàn)成單個細胞？因為這些組織或器官，分裂能力旺盛(wàngshèng)，易于培養(yǎng)。成塊組織使細胞靠在一起限制了細胞的生長和增殖，分散做成細胞懸浮液有利于培養(yǎng)。5、培養(yǎng)瓶中的細胞會充滿整個培養(yǎng)瓶嗎？不會，細胞會貼壁分裂生長到表面相互接觸時，細胞分裂就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象叫接觸抑制。第十二頁，共四十四頁。7、胰蛋白酶的作用(zuòyòng)是什么呢？由此可說明細胞間的物質是什么成份？催化蛋白質水解。細胞(xìbāo)間的物質主要是蛋白質(膠原蛋白等)8、細胞膜的主要成份(chéngfèn)是什么？蛋白質和磷脂6、把細胞繼續(xù)轉移到其他培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，怎樣操作？將貼滿細胞壁的細胞用胰蛋白酶處理，然后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，讓細胞繼續(xù)增殖。第十三頁，共四十四頁。10、既然胰蛋白酶能將細胞消化(xiāohuà)掉，那將動物組織分散成單個細胞要注意什么問題呢？11、能夠(nénggòu)用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？注意(zhùyì)時間的控制不能，因為兩者的最適PH不同，而正常組織細胞的生存環(huán)境與胰蛋白酶的最適PH較接近9、胰蛋白酶能將細胞消化掉嗎？能第十四頁，共四十四頁。1）無菌、無毒的環(huán)境(huánjìng)

保證細胞(xìbāo)順利的生長增殖

添加一定量的抗生素，定期(dìngqī)更換培養(yǎng)液添加：糖（葡萄糖）、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素、動物血清等。4、動物細胞培養(yǎng)的條件2）營養(yǎng)3）適宜的溫度和PH

培養(yǎng)室中控制,使之達到36.57.2~7.4O2（95%空氣）維持細胞的有氧呼吸5%CO2

維持培養(yǎng)液的PH4）氣體環(huán)境第十五頁，共四十四頁。植物(zhíwù)組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理

細胞的

細胞培養(yǎng)基特有成分植物激素

葡萄糖、培養(yǎng)結果植物體培養(yǎng)目的快速繁殖培育無病毒植株

獲得全能性增殖(zēngzhí)蔗糖(zhètáng)動物血清細胞株、細胞系細胞,某些蛋白質第十六頁，共四十四頁。5、動物細胞培養(yǎng)技術(jìshù)的應用（1）培養(yǎng)健康皮膚(pífū)細胞用于燒傷病人皮膚(pífū)移植（2）基因工程(jīyīngōngchéng)的受體細胞，生產蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（4）用于檢測有毒物質（3）細胞的生理、藥理、病理研究

第十七頁，共四十四頁。前景(qiánjǐng)展望資料(zīliào)一：第十八頁，共四十四頁。

培養(yǎng)(péiyǎng)的動物細胞可以用于檢測有毒物質。許多致畸、致癌物質加入培養(yǎng)液后，培養(yǎng)細胞會發(fā)生染色體結構和數(shù)目的變異。根據(jù)變異細胞占全部培養(yǎng)細胞的百分數(shù)，可以判斷某種物質的毒性?，F(xiàn)在動物細胞培養(yǎng)已經(jīng)成為檢測有毒物質的快速而靈敏的有效手段。資料(zīliào)二：第十九頁，共四十四頁。人工關節(jié)——軟骨(ruǎngǔ)再生1.第一次手術:從病人關節(jié)軟骨中未受力的部分，取出一片約為葡萄干大小的健康軟骨組織。2.分離軟骨細胞并經(jīng)三星期的體外培養(yǎng)，使細胞數(shù)增加(zēngjiā)約10～20倍。3.第二次手術:清理軟骨受損的部分，從下方骨頭部位取出一片約與傷口大小相同的骨膜，縫在傷口上方，再將軟骨細胞注射到骨膜下方。資料(zīliào)三：結果:經(jīng)過復健一年后即可恢復正常的生活。第二十頁，共四十四頁。二、動物(dòngwù)細胞核移植

動物核移植是將動物的一個細胞的細胞核,移入一個已經(jīng)(yǐjing)去掉細胞核的卵母細胞中.使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體.克隆(kèlónɡ)動物：用核移植的方法得到的動物。1、概念：第二十一頁，共四十四頁。克隆羊培育(péiyù)過程黑面綿羊去核卵細胞白面綿羊乳腺細胞核細胞核移植重組細胞電脈沖刺激早期胚胎胚胎移植另一頭綿羊(miányáng)的子宮妊娠、出生克隆羊多利無性生殖(wúxìngshēngzhí)第二十二頁，共四十四頁。2、體細胞核移植技術(jìshù)的應用前景

1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良(gǎiliáng)的進程2、保護瀕危(bīnwēi)物種3、生產醫(yī)用蛋白質及組織器官的移植的供體第二十三頁，共四十四頁。3、體細胞核移植技術(jìshù)存在的問題1、克隆動物基因組重新編程的機制尚不清楚。2、克隆技術效率低，畸形(jīxíng)率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問題。3、生產克隆動物費用昂貴。第二十四頁，共四十四頁。

細胞融合是正常(zhèngcháng)的生命活動兩個細胞正在(zhèngzài)融合

受精(shòujīng)作用三、動物細胞融合第二十五頁，共四十四頁。細胞(xìbāo)A細胞(xìbāo)B雜種(zázhǒng)細胞滅活的病毒物理法化學法三、動物細胞融合仙臺病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒第二十六頁，共四十四頁。用滅活的病毒誘導動物(dòngwù)細胞融合過程細胞核病毒顆粒細胞核第二十七頁，共四十四頁。細胞融合(rónghé)與融合(rónghé)誘導細胞融合(rónghé)物質誘導劑：病毒、聚乙二醇

誘導細胞融合的病毒必須滅活。

思考(sīkǎo)討論：為什么細胞融合過程中使用的病毒需要滅活？第二十八頁，共四十四頁。四、單克隆抗體(kàngtǐ)什么是抗體？抗體是機體受抗原刺激后產生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結合的具有(jùyǒu)免疫功能的球蛋白。效應B細胞產生抗體１．B淋巴細胞受抗原刺激后，可以產生抗體。２．動物體內的B淋巴細胞可以產生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用(zuòyòng)。３．每一個淋巴細胞只能產生一種抗體。第二十九頁，共四十四頁。單克隆抗體(kàngtǐ)由單個B淋巴細胞經(jīng)過無性繁殖（克隆(kèlónɡ)），形成基因型相同的細胞群，這一細胞群所產生的化學性質單一、特異性強的抗體稱為單克隆(kèlónɡ)抗體。

特點：特異性強、靈敏度高如何(rúhé)大量生產單克隆抗體？第三十頁，共四十四頁。如何大量生產(shēngchǎn)單克隆抗體？利用淋巴細胞產生抗體的功能利用腫瘤細胞無限增殖的特性(tèxìng)利用細胞融合的技術將兩種細胞融合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞利用動物細胞培養(yǎng)技術大量培養(yǎng)雜交瘤細胞第三十一頁，共四十四頁。

單克隆抗體制備(zhìbèi)過程

注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選(shāixuǎn)雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產生特定(tèdìng)抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體第三十二頁，共四十四頁。思考(sīkǎo)：1、本過程(guòchéng)利用了哪些原理？免疫(miǎnyì)原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理2、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領，因而可以獲得大量單克隆抗體3、與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體有什么優(yōu)點？產量高，特異性強，靈敏度高第三十三頁，共四十四頁。4、整個制備過程(guòchéng)為何要經(jīng)過兩次篩選?第一次篩選得到雜交瘤細胞（多種），第二次需先在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有(zhǐyǒu)一個雜交瘤細胞的情況下開始培養(yǎng)，然后再篩選出能產生特異性抗體的細胞群。由于該細胞群是單個雜交瘤細胞克隆得來的，所以產生的抗體必然是化學性質單一的，特異性強的單克隆抗體。這里的單克隆的確有單個細胞克隆的含義，只不過克隆的不是B淋巴細胞，而是雜交瘤細胞。第三十四頁，共四十四頁。BBBB瘤瘤瘤瘤5、細胞融合后培養(yǎng)液中有幾種(jǐzhǒnɡ)細胞？6、單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導(yòudǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細胞是（）①淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞自身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞⑤雜交瘤細胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③C第三十五頁，共四十四頁。單克隆抗體(kàngtǐ)的應用1、臨床(línchuánɡ)診斷2、作為載體(zàitǐ)，運載抗癌藥物，形成“生物導彈”治療腫瘤資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內診斷，借以鑒別和定位體內“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。第三十六頁，共四十四頁。第三十七頁，共四十四頁。第三十八頁，共四十四頁。第三十九頁，共四十四頁。植物體細胞雜交和動物(dòngwù)細胞融合的比較比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合細胞融合原理細胞膜的流動性細胞膜的流動性細胞融合的方法去除細胞壁后誘導原生質體融合使細胞分散后誘導細胞融合誘導方法物理（離心、振蕩、電刺激）化學（聚乙二醇）物理、化學方法（同左）滅活的病毒用途獲得雜種植株制備單克隆抗體第四十頁，共四十四頁。

下圖為某同學根據(jù)雜交瘤技術的方法，設計(shèjì)的生產破傷風桿菌的實驗方案2、該方案能達到預期效果嗎？為什么？4、圖中為

過程，常用

_________作為誘導劑，該細胞繼承

___________的遺傳特性，既能

__________,又能___________。1、該實驗方案的目的是_____________3、是從小鼠的脾臟中取得

,

該細胞能夠產生______效應(xiàoyìng)