細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)p

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用中山大學(xué)動物實驗中心郭中敏2015.09.07概述隨著現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)在其領(lǐng)域和相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛。目前，細(xì)胞可以用來用來生產(chǎn)蛋白生物制品、臨用于移植、用于檢測物質(zhì)、用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)。由于在培養(yǎng)中或機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞行為的基本規(guī)律是一樣的，因此許多研究可以在體 行。更重要的是，在體外培養(yǎng)條件下，人們可以有目的、有選擇的控制細(xì)胞生長的因素環(huán)境，因此可以研究在某些特殊條件下的細(xì)胞生物學(xué)行為，這里主要目的是介紹細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念和技術(shù)及其應(yīng)用。體外培養(yǎng)中感的研究領(lǐng)域和轉(zhuǎn)錄、蛋白1)細(xì)胞質(zhì)2)細(xì)胞的種種活動,如DNA的、能量代謝;的流動,如RNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)方向運(yùn)轉(zhuǎn),激素受體復(fù)合物的易位等;3)生態(tài)學(xué),如營養(yǎng)、

或化學(xué)誘變、藥物作用;4)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用,如胚胎誘導(dǎo)、細(xì)胞群體的動力學(xué)等。5)組織工程:

細(xì)胞＋生物材料6)干細(xì)胞的研究與應(yīng)用內(nèi)

容一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本理論二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件三、基本的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)四、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本理論（一）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的歷史（二）基本概念、基本理論（一）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的歷史1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液,并首次采用組織培養(yǎng)這個術(shù)語。1907年Harrison

和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動物細(xì)胞的培養(yǎng)。1912年Carrel將無菌操作技術(shù)引入動物細(xì)胞培養(yǎng)，在動物體液中發(fā)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞生長的因子，奠定了無 培養(yǎng)研究基礎(chǔ)。1962年Stile成功的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)了小鼠腎細(xì)胞（BHK），從而為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。1967年Wezel和1972年Knazek先后創(chuàng)立了微載體和空纖維細(xì)胞培養(yǎng)體系，使細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)提高到大規(guī)模培養(yǎng)水平。體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展大致可分三個時期：50年代之前，細(xì)胞培養(yǎng)在多個領(lǐng)域發(fā)展時期；50年代是細(xì)胞培養(yǎng)迅猛發(fā)展時期，多種培養(yǎng)技術(shù)相繼建立；50年代后是體外培養(yǎng)技術(shù)與生命科學(xué)其他技術(shù)結(jié)合發(fā)展的新時期，誕生了多種培養(yǎng)應(yīng)用技術(shù)。我國體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展：20世紀(jì)50年代以后，如張鈞、鮑鑒清分別在上海、

開展部分相關(guān)工作1952

鮑鑒清

第一1955

編寫第一本《組織培養(yǎng)技術(shù)》1995年鄂征主編《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》一書其他還有：郭輝玉、高尚蔭、鄂征、陳瑞銘等.由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，如抗的生產(chǎn)等，現(xiàn)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一門精細(xì)技術(shù)。許多細(xì)胞株、細(xì)胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細(xì)胞系，如Hela細(xì)胞系（Gey，1952），可用來進(jìn)行一系列研究，更加促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。在兩種不同類型的細(xì)胞混合培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)有自發(fā)的兩類不同細(xì)胞間的融合細(xì)胞后，為細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)以及雜交瘤技術(shù)奠定了基礎(chǔ),并推動了細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、學(xué)等學(xué)科的交叉與發(fā)展。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)間的相互滲透交叉，分子克隆技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，在闡明

的結(jié)構(gòu)和功能、

在細(xì)胞生長和分化中的作用，以及細(xì)胞

機(jī)制等方面起了重要作用。如

的克隆及在細(xì)胞中的作用、克隆癌基因與細(xì)胞生長分化的關(guān)系，以及反義癌

RNA對細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制作用的方面起了重要作用。（二）基本概念1、體外培養(yǎng)分類組織培養(yǎng)(TissueCulture)：從體內(nèi)取出組織摹擬體內(nèi)生理環(huán)境,在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture):從動物機(jī)體內(nèi)取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細(xì)胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖其原理是細(xì)胞增殖。培養(yǎng)（Organ Culture）：培養(yǎng)的是 的原基、 的一部分或整個

,使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。（如下圖）2、組織培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特點2.1體內(nèi)外細(xì)胞的差異：人工條件和體內(nèi)實際情況不完全相同時,細(xì)胞在體外培養(yǎng)后,一旦失去神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響,

缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中,則發(fā)生變化。細(xì)胞變化最多見的表現(xiàn)是:返祖（Atavism）現(xiàn)象——失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱或不顯、細(xì)胞趨單一化、不死性、惡性狀。細(xì)胞增殖和分化是細(xì)胞生命進(jìn)化中所獲得的基本屬性,增殖使細(xì)胞數(shù)量增多;分化使機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能多樣化,最后演變成完整的有機(jī)體。2.2培養(yǎng)細(xì)胞的分化細(xì)胞分化機(jī)制是極其復(fù)雜的,是在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與體液和細(xì)參與、經(jīng)過多階段和多環(huán)節(jié)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用下,眾多完成的動態(tài)演變過程。不適應(yīng)（Deadaption）——細(xì)胞在體內(nèi)時所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細(xì)胞在體外喪失了產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶的特性。脫分化和去分化（Dedifferentiation）——由于變異而使細(xì)胞失去分化能力。如肝細(xì)胞失掉產(chǎn)氨酸酶及氨基酸轉(zhuǎn)移酶的特性后,肝糖元的能力喪失,并很難再現(xiàn)。因此,不適應(yīng)和脫分化是兩個不同概念，不適應(yīng)只是因為生存條件改變而使分化發(fā)生抑制;從分子水平考慮,脫分化很可能是變異所導(dǎo)致。3、培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)3.1.貼附型：成纖維細(xì)胞：心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等上皮型細(xì)胞：消化管外皮細(xì)胞，肝臟上皮細(xì)胞等型細(xì)胞：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞多形型細(xì)胞：神經(jīng)組織細(xì)胞3.2.懸浮型：如癌細(xì)胞和血液白細(xì)胞4、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長增殖過程原代培養(yǎng)期:從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)這個階段，一般持續(xù)1-4周。這個階段細(xì)胞比較活躍，有細(xì)胞，但不旺盛。傳代期：從原代培養(yǎng)的細(xì)胞的一經(jīng)傳代后便稱細(xì)胞系。細(xì)胞增殖旺盛，當(dāng)傳代10-50次后，細(xì)胞增殖緩慢，以致完全停止。期：細(xì)胞增殖緩慢或不增殖。細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，最后

凋亡。4.1

原代培養(yǎng)（Primary

Culture）期：即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動，可見細(xì)胞 ，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性較大，細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時，細(xì)胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低，即細(xì)胞獨立生存性差?？寺⌒纬陕剩杭醇?xì)胞群被稀釋分散成單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時，形成細(xì)胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。4.2傳代期初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱做細(xì)胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（Diploid

Cell

Line）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后進(jìn)行早期凍存。當(dāng)前世界上常用的二倍體細(xì)胞一般不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存，但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。4.3期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后 凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或 期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous

Transformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系（Infinite

Cell

Line），也稱連續(xù)細(xì)胞系（ContinuousCellLine）。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。初代培養(yǎng)細(xì)胞系（連續(xù)細(xì)胞系）老化傳代期024681012周65、組織培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到一定密度后，都需要做傳代處理，傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞增殖速度有關(guān)。所謂細(xì)胞“一代”即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。如某一細(xì)胞系為

50代即該細(xì)胞已傳代50次。Hayflick極限體外培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力不是無限的，傳代次數(shù)有一定的界限，稱為“Hayflick極限”。3年，傳傳代次數(shù)與物種 有關(guān)：小鼠代12次；龜200年，傳代140次。傳代次數(shù)與 成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病兒童，2-10代。細(xì)胞傳代的三個階段：（1）潛伏期（Latent

phase）：細(xì)胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間。2倍體細(xì)胞該期時間長（

24-96h

），連續(xù)細(xì)胞系時間短（

10-30min）。（2)指數(shù)生長期（Logarthmicgrowthphase）：細(xì)胞增殖最旺盛時期，一般用細(xì)胞

指數(shù)（MitoticindexMI）表示：即細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞指數(shù)介于0.1-0.5%，且受細(xì)胞種類培養(yǎng)液成分、pH溫度等影響。指數(shù)生長期是細(xì)胞最好的時期，在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯片，呈現(xiàn)接觸抑制（

Contactinhibition）。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。但癌細(xì)胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Density

inhibition）。（3)停滯期（Stagnate

phase）：即細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營養(yǎng)液的交換面積減少,代謝產(chǎn)物積累,PH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。在此時應(yīng)及時進(jìn)行換液傳代，否則因細(xì)胞 受損，大量細(xì)胞出現(xiàn) ，至少再傳1-2代后，細(xì)胞才能恢復(fù)。二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件（一）儀器和設(shè)備:1、常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：超凈臺、CO2孵箱、倒置顯微鏡、-80℃冰箱、液氮灌2、培養(yǎng)器材：培養(yǎng)瓶、離心管、凍存管、純水設(shè)備、干燥 除菌設(shè)備以及設(shè)備等。3、培養(yǎng)箱中控制條件：溫度：36.5

±0.5℃濕度：100%CO2濃度：5%（二）培養(yǎng)液:1、常用的培養(yǎng)基：目前常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液均有商品化,如RPMI1640，MEM，DMEM，F(xiàn)12等,可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。液體、粉末（hepes、NaHCO3）2、配制低糖DMEM培養(yǎng)基：試劑名稱體積（質(zhì)量）低糖DMEM培養(yǎng)基（干粉）10.0gHEPES2.2gNaHCO32.0g雙抗100×,10ml于超凈臺內(nèi)操作,加入三蒸水,充分溶解后,三蒸水定容到1000ml,

0.22μm濾膜過濾，-20oC保存?zhèn)溆?

、緩沖系統(tǒng)：常用為HEPES(N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonic

acid)，緩沖效能(pKa)在20℃時為7.55，37℃為7.31。HEPES不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調(diào)整pH常常用NaHCO3溶液。（三）細(xì)胞培養(yǎng)添加劑：1、

:一般最常用新生牛

、胎牛，也用人

和其它動物。由于不同的研究目的，

成分往往干擾研究實驗，如進(jìn)行某些藥物和受體及特殊營養(yǎng)方面研究時，要使用無

培養(yǎng)基。質(zhì)量：批間差異很大。濃度：10%—20%作用：營養(yǎng)、促細(xì)胞繁殖、中和胰酶2、有機(jī)補(bǔ)充物：如酸鈉,谷胺酰氨等;3、促細(xì)胞因子：如生長因子類如FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)，EGF(表皮生長因子);貼壁和鋪展因子：如膠原蛋白、纖粘蛋白等，可根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特殊要求進(jìn)行添加。濃度：一般為10—30μg/ml(四)

平衡鹽溶液:1、作用：主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細(xì)胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng),使培養(yǎng)液的酸鹼度維持在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)，提供細(xì)胞正常代謝所需的水分和無機(jī)離子等。2、常用有：PBS,、Hank’s以及生理鹽水等，其配方可參考有關(guān)書籍。3、配制無鈣、鎂離子的1×PBS緩沖液（1000ml）藥品名稱質(zhì)量(g)NaCL8.0Na2HPO4.12H2O2.88KCL0.2KH2PO40.2加三蒸水定容至1000ml，攪拌，使之充分溶解，過濾或高壓滅菌備用。（五）消化液：1、種類：胰酶消化液、胰酶+乙二胺四乙酸(Ethylene

Diamine

TetraaceticAcid，EDTA

）、膠原酶等。2、特性：具有普通酶的特性3、影響因素：藥品名稱質(zhì)量/體積(g/ml)胰蛋白酶（Trypsin）0.25g乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）0.04gPBS100ml配制0.25%Trypsin-EDTA消化液充分溶解后,0.22μm濾膜過濾，-20oC保存?zhèn)溆谩?六)抗生素:青霉素(每毫升培養(yǎng)液50-100單位)鏈霉素(每毫升培養(yǎng)液50-100微克)兩性霉素（每毫升培養(yǎng)液20-25微克）。（七）細(xì)胞凍存液1、由含20%—70%

的培養(yǎng)基和二甲基亞砜（dimethylsulfoxide

，DMSO

）組成。2、DMSO作用：防止細(xì)胞因溫度劇烈變化導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂藥品名稱體積(ml)DMEM培養(yǎng)基703、凍存液配制20二甲基亞砜（DMSO）

10無菌操作將三者混合均勻后，低溫?zé)o菌條件下保存（八）培養(yǎng)液的物理性質(zhì)PH：大多數(shù)細(xì)胞在PH7.0-7.4時生長最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚紅-常用的指示劑，用來檢測PH的變化。紅色PH7.4；橙色PH7.0；黃色PH6.5；紅藍(lán)色PH7.6，紫色PH7.8。（九）培養(yǎng)細(xì)胞的影響因素1、溫度：溫度除直接影響細(xì)胞生長外，與培養(yǎng)液的PH值有關(guān)，溫度低時CO2溶解性增加，從而影響PH。2、滲透壓:3、粘度:4、表面張力三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法(一)解離組織1.解離組織:在無菌情況下采取動物的組織或,放在含有抗生素的平衡鹽溶液(BSS)中,然后盡快在超凈臺或無菌室內(nèi)進(jìn)行解離處理.解離時應(yīng)注意:盡可能將脂肪和壞死組織去除干凈;剪碎組織時,避免損傷組織塊;解離組織用的各種酶系,需要先進(jìn)行低速離心。1、意義（1） 具有均勻細(xì)胞層的培養(yǎng)物；（2）從單個細(xì)胞出發(fā)獲得細(xì)胞群體；從一定量的組織中獲得最多的細(xì)胞量時，常用酶和鰲合劑進(jìn)行解離。(二)解離細(xì)胞胰蛋白酶解離細(xì)胞法：膠原酶解離細(xì)胞法：這種方法對解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的.膠原酶和透明質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織.膠原酶最終濃度200u/ml,36.5℃溫育,一般溫育4-48h.機(jī)械解離細(xì)胞法：2、方法細(xì)胞計數(shù)準(zhǔn)備計數(shù)板：準(zhǔn)備細(xì)胞懸液：要求細(xì)胞密度不低于104個/ml，若細(xì)胞數(shù)很少，應(yīng)將懸液離心（1000r/min,5min），重懸浮于少量培養(yǎng)液中。消化單層細(xì)胞時，務(wù)求細(xì)胞分散良好，制成單細(xì)胞懸液。加樣：取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液。加樣時不要溢出蓋玻片也不能溢入兩側(cè)的玻璃槽內(nèi)，如果產(chǎn)生上述情況需對計數(shù)板沖洗和拭干后重新加樣，加樣量也不要太少或帶氣泡。計數(shù)：在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞壓中線時只計左側(cè)和上方，不計右側(cè)和下方。細(xì)胞記數(shù)鏡下計數(shù)時，遇見2個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計數(shù)。如細(xì)胞團(tuán)10%以上，說明消化不充分，或細(xì)胞數(shù)少于2個/mm2或多于50個/mm2，說明稀釋不當(dāng)，需重新 細(xì)胞懸液，計數(shù)。記數(shù)公式:細(xì)胞濃度(細(xì)胞個數(shù)/每毫升)=(4個大方格細(xì)胞總數(shù)/4)×104×細(xì)胞原液稀釋倍數(shù)（三）原代細(xì)胞培養(yǎng)外植塊培養(yǎng):外植塊在一定限度內(nèi)可保持其原有組織結(jié)構(gòu),有利于其適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境。短期培養(yǎng)的外植塊成為細(xì)胞培養(yǎng)的材料來源之一。單層細(xì)胞培養(yǎng):每隔1-3d換液一次,細(xì)胞長成單層后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。懸浮細(xì)胞培養(yǎng):使細(xì)胞成懸浮狀態(tài)在培養(yǎng)液中連續(xù)生長,或者由于細(xì)胞本身是不粘附的,如小鼠白血病細(xì)胞和腹水腫瘤細(xì)胞,或者是通過機(jī)械攪動使細(xì)胞保持懸浮狀態(tài),也可以通過選擇培養(yǎng)得到能懸浮生長的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。（四）細(xì)胞培養(yǎng)中的問題1、培養(yǎng)液和培養(yǎng)物:一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長,不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度。2、PH:初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4,培養(yǎng)過程應(yīng)不低于7.0。3、培養(yǎng)瓶內(nèi)的空間:一般培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10。4、容積、深度、表面面積:培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.2-0.5ml/cm。5、去除死細(xì)胞:細(xì)胞

后

有害因子6、溫度控制:動物細(xì)胞培養(yǎng)對溫度波動的敏感性很大。溫度低于36.5℃,細(xì)胞生長緩慢;溫度高于37℃,細(xì)胞失去存

。因此應(yīng)按要求嚴(yán)格控制溫度。歸納過程細(xì)胞懸浮液貼滿瓶壁的細(xì)胞取

動物胚胎或幼齡動物

的組織、

胰蛋白酶單個細(xì)胞加入

培養(yǎng)

液接觸抑制原代培養(yǎng)1-10代細(xì)胞原代細(xì)胞加

培養(yǎng)

液10—50代細(xì)胞遺傳物質(zhì)

未改變遺傳物質(zhì)改變無限傳代已傳代培養(yǎng)胰蛋白酶（五）細(xì)胞系及其鑒定1、細(xì)胞系：原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細(xì)胞類型多而復(fù)雜，因此在培養(yǎng)初期，存活和生長的細(xì)胞類型也是多種多樣的。所以再培養(yǎng)不僅僅是為了維持細(xì)胞不斷地生長，而且是培養(yǎng)物逐步演進(jìn)為具有增殖能力、特征專一、類型均勻的細(xì)胞，即細(xì)胞系(Cell

line)。2、鑒定內(nèi)容細(xì)胞系建立后，應(yīng)對細(xì)胞系進(jìn)行一系列鑒定，才能應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的研究。鑒定內(nèi)容應(yīng)包括:細(xì)胞系的細(xì)胞來源：鑒定細(xì)胞系的純度：即除了主類細(xì)胞外,還雜有哪類細(xì)胞細(xì)胞系的穩(wěn)定性：即在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)過程中主要指標(biāo)應(yīng)無明顯變化。累積細(xì)胞系的形態(tài)及其表達(dá)特征的基本數(shù)據(jù)，以及其與來源細(xì)胞的差異等。3、鑒定指標(biāo)數(shù)目和核型分析以及染形態(tài)學(xué):包括色體分帶技術(shù)。3.同工酶譜：通常以G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、LDH(乳酸脫氫酶)、核苷磷酸化酶三種方法，可根據(jù)條件選擇。4.細(xì)胞DNA遺傳特征:限制性片斷長度多態(tài)性(restriction

fragment

lengthpolymorphismRFLP)，是指在生物進(jìn)化過程中,DNA序列發(fā)生某些中性突變，突變的結(jié)果是失去或獲得一個酶切點,因此當(dāng) 組DNA用限制性內(nèi)切酶酶切后，限制性內(nèi)切酶片斷加長或縮短，用同源的克隆DNA為探針就可以探測出。另外也可能在生物進(jìn)化過程中DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，使DNA堿基排列序列改變,影響內(nèi)切酶切點，使內(nèi)切酶酶切片斷呈多態(tài)性。一般采用Southern印跡雜交法檢測。（六）細(xì)胞克隆技術(shù)一個克隆的細(xì)胞群體是從一個單一母細(xì)胞繁殖而來，分離單一細(xì)胞并使其繁殖為一細(xì)胞群體的方法成為克隆化(cloning)。細(xì)胞克隆技術(shù)的方法稀釋鋪板法(見圖)飼養(yǎng)層克隆法(見圖)膠原膜板或纖維蛋白膜板克隆法瓊脂克隆法(見圖)在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆法.(見圖)（七）培養(yǎng)細(xì)胞的1、各種生物體細(xì)胞

各有其一定的數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)，其可作為特化細(xì)胞的基本標(biāo)志。是一種鑒定細(xì)胞系的種屬、來源較為確切的指標(biāo)；也是檢查細(xì)胞系是否趨于穩(wěn)定，在離體培養(yǎng)條件下細(xì)胞有否發(fā)生轉(zhuǎn)化的可靠指標(biāo)，是區(qū)別正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞的指標(biāo)。2、測定項目數(shù)目核型分析分帶技術(shù)：G-,C-帶分析3、具體操作步驟培養(yǎng)細(xì)胞：取處于對數(shù)生長期，用較大瓶皿培養(yǎng)的80-90%匯合單層培養(yǎng)細(xì)胞。加秋水仙素：使用最終濃度為0.02-0.8mg/ml營養(yǎng)液，溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6-10小時。細(xì)胞：可利用

中期細(xì)胞體變圓與底物附著不牢固的特點，手持培養(yǎng)瓶，左右反復(fù)橫向水平搖動，令培養(yǎng)液在培養(yǎng)細(xì)胞表面反復(fù)沖涮，這樣約可使90%的中期

細(xì)胞從瓶壁脫落；注意勿用力過猛，以防多量

裂細(xì)胞脫落影響觀察。離心：收集培養(yǎng)液，1000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘。低滲處理：吸取上清液，加入預(yù)溫至37oC的0.075MKCL溶液，在溫箱中靜置20-30分鐘。6）預(yù)固定：向懸液中加新鮮1：3醋酸甲醇固定液1ml，用吸管吹打均勻；此操作起到使細(xì)胞表面輕微固定，可防止固定后細(xì)胞粘連成塊。7）固定：離心，同4），吸除上清液，加新鮮固定液5-10ml，要用一手微斜持離心管，另一手用吸管吸取固定劑，將固定劑逐滴滴在離心管壁上，使之緩慢流入離心管中，輕輕吹打均勻，放置

15-20分鐘。8）重復(fù)7），末次離心后，

吸除大部分上清，據(jù)懸液中細(xì)胞密度大小，余下固定液0.5-1ml。9）制作：用滴片法制片，按如下步驟：將潔凈的載玻片放4°C冰箱預(yù)冷，滴片前從冰箱取出冷載物片一張，在載玻片表面出現(xiàn)微細(xì)水氣時，立即向片心一側(cè)滴2-3滴細(xì)胞懸液（如固定液不散開，可能因載玻片未洗凈或不冷所致）。滴片時的距離保持半米高度較好。滴片在室溫中自然干燥，然后鏡下觀察并記數(shù)

數(shù)。10）染色和封片：一般常用Giemsa染色，取Giemsa1份+9份PH6.8磷酸緩沖液混均勻，染色10分鐘后，水洗，晾干，直接觀察（適用油鏡），如標(biāo)本需要保存或做長期觀察，可過二次二甲苯，用中性樹膠封片。該過程難在制出的標(biāo)本不是非常理想和一致，常出現(xiàn) 指數(shù)少， 分散不良，或染色體過短等，為此在初做時，應(yīng)做預(yù)實驗，摸清條件，提高成功率。（八）培養(yǎng)細(xì)胞的污染與檢測細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題非常重要，否則將會前功盡棄。細(xì)胞培養(yǎng)一定要建立無菌觀念，遇到培養(yǎng)污染要分析原因,及時處理。1、細(xì)胞污染的種類和判定細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌和支原體。在出現(xiàn)以下情況時培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染:培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。光鏡觀察到菌絲、菌膜和顆粒。細(xì)胞出現(xiàn)

或增殖緩慢等。2、污染物的檢測細(xì)菌和真菌污染：細(xì)菌可采用涂片染色鏡檢的方法；真菌可用相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行檢測。支原體檢測:支原體污染細(xì)胞后,能抑制細(xì)胞代謝和生長,改變核酸，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞改變，干擾的，以及具有類作用。支原體引起的一些細(xì)胞變化，可以繼續(xù)傳代下去，但在培養(yǎng)細(xì)胞時由于起初對細(xì)胞的繁殖影響較小而往往不引起重視，因此支原體應(yīng)作為常規(guī)檢測。霉菌污染白色念球菌念珠菌污染革蘭 桿菌：洋蔥佰克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）污染細(xì)菌污染高倍鏡（1000倍），瑞氏染色黑焦蟲污染真菌污染HSC-T6真菌污染3、支原體檢測方法和處理1）熒光技術(shù)檢測:支原體含有DNA,能與一種熒光Hoechest

33258特異性的結(jié)合,可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來顯示細(xì)胞是否污染有支原體.2）直接培養(yǎng)法:

常用放射自顯影檢測:DNA分子雜交:3)

污染支原體的處理:

抗生素處理；共培養(yǎng)法;重新克隆法；過濾法。4、檢測CPE或集落的檢測;血細(xì)胞吸附試驗;雞胚接種.（九）細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、胞。向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使冰點降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。在－130℃以下低溫中能減少冰晶的形成。溶解細(xì)胞時，速度要快使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－5℃～0℃后，細(xì)胞仍能生長，不受損害。1、凍存：（1）原理在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會形成結(jié)晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列變化如電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水等，能引起細(xì)（2）注意事項：①消化細(xì)胞不要過度②凍存液7：2：1或4：5：1DMSO為無色純品，變黃勿用。③溫度：要逐步降溫從4℃30m--20℃30m---④70℃1-2h,然后移入液氮罐內(nèi)。⑤細(xì)胞：對數(shù)生長期旺盛的細(xì)胞⑥做好記錄：名稱、日期、數(shù)量（還有代數(shù))2.復(fù)蘇(1)將凍存于液氮中的凍存管取出，迅速放入37～40℃水浴中使其在1min內(nèi)融化。(2)無菌操作下打開凍存管，將細(xì)胞懸液移至離心管中，補(bǔ)加10ml培養(yǎng)液，500～1000rpm低速離心5min，去上清（DMSO

在常溫下對細(xì)胞，應(yīng)在細(xì)胞復(fù)蘇后盡量除去），用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后裝入培養(yǎng)瓶中置37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長至一定密度后即可傳代。＃凍存要慢，復(fù)蘇要快(3)細(xì)胞能否順利復(fù)蘇，影響因素較多，如凍存時細(xì)胞的狀態(tài)以及有無污染等。目前，有學(xué)者介紹還應(yīng)注意一點，即

細(xì)胞溶解后，可緩慢加入10倍凍存液的應(yīng)用液培養(yǎng)12－48h，

液。目的是逐漸稀釋細(xì)胞和保護(hù)劑，避免細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓變化過于迅速而使部分細(xì)胞3.細(xì)胞的選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，充滿新培養(yǎng)液，液量要達(dá)到培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞以膠塞保留微量空氣。若空氣留量過多，時大氣泡來回流動對細(xì)胞有干擾作用。妥善包裝、。一般在四五天內(nèi)到達(dá)目的地，對細(xì)胞無多大影響，時間過長則細(xì)胞下降。到達(dá)目的地后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細(xì)胞生長所需的液量，置37℃培養(yǎng)，次日傳代。四、細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域：1、測試藥物的效應(yīng)2、雜交瘤技術(shù)中。3、

轉(zhuǎn)導(dǎo)（Gene

transfer)4、組織工程中5、胚胎干細(xì)胞的相關(guān)研究與應(yīng)用、致1、測試藥物效應(yīng)適用于研究抗癌藥物和致畸、突變的藥物。范圍：鑒定有潛在活性的化合藥物藥物發(fā)揮毒性的作用機(jī)制可能用于臨床的有效的細(xì)胞毒性藥物多種化合物中篩選有效成分及活性范圍確定效應(yīng)細(xì)胞類型確定毒性范圍研究藥物濃度與

時間的關(guān)系2、轉(zhuǎn)導(dǎo)方面應(yīng)用當(dāng)一個

被克隆后，檢