與陰離子交換課件

離子交換層析

ionexchangechromatography離子交換層析

ionexchangechr1一、原理

離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的層析方法。?

即溶液中的離子同離子交換劑上功能基團(tuán)交換反應(yīng)的過(guò)程。一、原理

離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)2與陰離子交換課件3

帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來(lái)。帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)，帶電4與陰離子交換課件5離子交換過(guò)程示意：起始吸附解吸完成x+:起始緩沖離子

y++：待分離離子

z+：待分離離子

離子交換過(guò)程示意：6二、離子交換劑的種類

在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即離子交換劑。（一）按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同陽(yáng)離子交換劑—帶負(fù)電荷，與陽(yáng)離子交換陰離子交換劑—帶正電荷，與陰離子交換二、離子交換劑的種類

在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即7（二）按載體種類不同1.離子交換樹(shù)脂：主要有聚苯乙烯樹(shù)脂苯乙烯+二乙烯苯

聚苯乙烯（單體）（交聯(lián)劑）二乙烯苯交聯(lián)度=————————×100%苯乙烯+二乙烯苯（二）按載體種類不同8交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進(jìn)入樹(shù)脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。在不影響分離的情況下，以采用交聯(lián)度較高的樹(shù)脂為好，這樣可以提高樹(shù)脂對(duì)離子的選擇性。交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進(jìn)入樹(shù)脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子9目數(shù)：離子交換樹(shù)脂的顆粒直徑大小Dowex50為20-50目Dowex20840m50297m100149m（代表二乙烯苯的百分含量）目數(shù)：離子交換樹(shù)脂的顆粒直徑大小10樹(shù)脂resin（據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分）陽(yáng)離子交換樹(shù)脂

強(qiáng)酸型含磺酸基團(tuán)(R-SO3H)

中等酸型含磷酸基團(tuán)(-O-PO2H4)

弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹(shù)脂

強(qiáng)堿含季胺基團(tuán)[-N+(CH3)3]

弱堿含叔胺、伯胺基團(tuán)[-N(CH3)2]陰離子交換樹(shù)脂對(duì)化學(xué)試劑及熱都不如陽(yáng)離子交換樹(shù)脂穩(wěn)定。

樹(shù)脂resin（據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分）112.離子交換纖維素陰離子交換纖維素—如:DEAE-纖維素pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì),具二乙胺乙基陽(yáng)離子交換纖維素—如:CM-纖維素一般pH>4條件下使用,具有羧甲基2.離子交換纖維素123.離子交換凝膠—分離大分子物質(zhì)如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、瓊脂糖（Sepharose）親水性強(qiáng),交換容量大,非專一性吸附小,球形顆粒,較纖維素離子交換劑的流速易控制床體積易受溶液的pH和離子強(qiáng)度影響3.離子交換凝膠—分離大分子物質(zhì)13三、操作注意點(diǎn)

（一）離子交換劑的選擇原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇—同一性質(zhì)離子交換劑中選用對(duì)被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差異大的型號(hào)交換劑，以保證通過(guò)離子交換層析后能得到比較滿意的結(jié)果。三、操作注意點(diǎn)

（一）離子交換劑的選擇14考慮因素：1.被分離物質(zhì)帶何種電荷2.被分離物質(zhì)分子的大小大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量考慮因素：15根據(jù)分離過(guò)程的實(shí)驗(yàn)條件強(qiáng)酸強(qiáng)堿—應(yīng)用廣泛弱酸型—只能在堿性pH范圍內(nèi)使用弱堿型—只能在酸性pH范圍內(nèi)使用根據(jù)分離過(guò)程的實(shí)驗(yàn)條件16（二）緩沖液的選擇原則：避免使樣品變性;不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng);在此pH條件下,被分離物質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)與交換劑上的平衡離子相同;

需考慮離子交換劑的性質(zhì);不影響被分離組分的分析測(cè)定.（二）緩沖液的選擇17(三)洗脫劑

原則：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的離子或基團(tuán)改變pH或離子強(qiáng)度增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力洗脫方式：梯度洗脫(三)洗脫劑18(四)操作1.離子交換劑的處理:除去過(guò)小的顆粒消除雜質(zhì)轉(zhuǎn)化平衡離子,調(diào)節(jié)所需的pH2.裝柱3.上樣4.洗脫5.洗脫液的收集和檢測(cè)6.再生(四)操作19四、應(yīng)用

分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子四、應(yīng)用

分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子20離子交換層析法分離氨基酸及測(cè)定

離子交換層析法分離氨基酸及測(cè)定21[原理]

所用樣品為天冬氨酸和組氨酸的混合液，分別屬酸性氨基酸(pI2.77)、堿性氨基酸(pI7.59)，用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂Dowex50，在一定的洗脫條件下洗脫，將它們分離。利用氨基酸可與茚三酮反應(yīng)生成有色化合物進(jìn)行氨基酸鑒定。[原理]所用樣品為天冬氨酸和組氨酸的混合液，分22紫色物質(zhì)，用于α－氨基酸的比色測(cè)定和紙層析顯色與水含茚三酮的反應(yīng)：紫色物質(zhì)，用于α－氨基酸的比色測(cè)定和紙層析顯色與水含茚三酮的23

AspHispH4.2pH>10Asp24[器材]

1.

層析柱等2.

沸水浴[器材]1.

層析柱等25[試劑]

Dowex500.1mol/LNaOHpH4.2檸檬酸緩沖液樣品液：氨基酸混合液茚三酮混合液[試劑]Dowex5026[操作]

1、層析：將Dowex50裝柱后，用0.1mol/LNaOH清洗樹(shù)脂5分鐘。再用pH4.2檸檬酸鈉緩沖液平衡10分鐘。（方法同凝膠層析法）加樣5-6滴。當(dāng)樣品進(jìn)入樹(shù)脂后，加入pH4.2檸檬酸緩沖液洗脫加樣后立即收集，每管收集3ml（控制流速15滴/分鐘）。當(dāng)?shù)谝环逡怀霈F(xiàn)，換用0.1mol/LNaOH作洗脫液，直至第二峰收集完畢。用pH4.2緩沖液再平衡10分鐘，再生。[操作]1、層析：將Dowex50裝柱后，用0.1mol/272、檢測(cè)：從第2管起每收集管中加入1.5ml茚三酮顯色液，充分混合，沸水浴15分鐘，自來(lái)水冷卻，觀察氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)，若生成紫色化合物，則說(shuō)明收集到氨基酸。2、檢測(cè)：從第2管起每收集管中加入1.5ml茚三酮顯色液，充28OperationofacationexchangecolumnfortheseparationoftheaminoacidsAsp,SerandLys.

Operationofacationexchange29Separationofaminoacidsonacationexchangecolumn

Separationofaminoacidsona30Differenttypesofionexchangeresins(a)Cationexchanger(b)Anionexchanger.Differenttypesofionexchang31梯度洗脫示意圖

梯度洗脫示意圖32離子交換層析

ionexchangechromatography離子交換層析

ionexchangechr33一、原理

離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的層析方法。?

即溶液中的離子同離子交換劑上功能基團(tuán)交換反應(yīng)的過(guò)程。一、原理

離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)34與陰離子交換課件35

帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來(lái)。帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)，帶電36與陰離子交換課件37離子交換過(guò)程示意：起始吸附解吸完成x+:起始緩沖離子

y++：待分離離子

z+：待分離離子

離子交換過(guò)程示意：38二、離子交換劑的種類

在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即離子交換劑。（一）按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同陽(yáng)離子交換劑—帶負(fù)電荷，與陽(yáng)離子交換陰離子交換劑—帶正電荷，與陰離子交換二、離子交換劑的種類

在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即39（二）按載體種類不同1.離子交換樹(shù)脂：主要有聚苯乙烯樹(shù)脂苯乙烯+二乙烯苯

聚苯乙烯（單體）（交聯(lián)劑）二乙烯苯交聯(lián)度=————————×100%苯乙烯+二乙烯苯（二）按載體種類不同40交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進(jìn)入樹(shù)脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。在不影響分離的情況下，以采用交聯(lián)度較高的樹(shù)脂為好，這樣可以提高樹(shù)脂對(duì)離子的選擇性。交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進(jìn)入樹(shù)脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子41目數(shù)：離子交換樹(shù)脂的顆粒直徑大小Dowex50為20-50目Dowex20840m50297m100149m（代表二乙烯苯的百分含量）目數(shù)：離子交換樹(shù)脂的顆粒直徑大小42樹(shù)脂resin（據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分）陽(yáng)離子交換樹(shù)脂

強(qiáng)酸型含磺酸基團(tuán)(R-SO3H)

中等酸型含磷酸基團(tuán)(-O-PO2H4)

弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹(shù)脂

強(qiáng)堿含季胺基團(tuán)[-N+(CH3)3]

弱堿含叔胺、伯胺基團(tuán)[-N(CH3)2]陰離子交換樹(shù)脂對(duì)化學(xué)試劑及熱都不如陽(yáng)離子交換樹(shù)脂穩(wěn)定。

樹(shù)脂resin（據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分）432.離子交換纖維素陰離子交換纖維素—如:DEAE-纖維素pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì),具二乙胺乙基陽(yáng)離子交換纖維素—如:CM-纖維素一般pH>4條件下使用,具有羧甲基2.離子交換纖維素443.離子交換凝膠—分離大分子物質(zhì)如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、瓊脂糖（Sepharose）親水性強(qiáng),交換容量大,非專一性吸附小,球形顆粒,較纖維素離子交換劑的流速易控制床體積易受溶液的pH和離子強(qiáng)度影響3.離子交換凝膠—分離大分子物質(zhì)45三、操作注意點(diǎn)

（一）離子交換劑的選擇原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇—同一性質(zhì)離子交換劑中選用對(duì)被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差異大的型號(hào)交換劑，以保證通過(guò)離子交換層析后能得到比較滿意的結(jié)果。三、操作注意點(diǎn)

（一）離子交換劑的選擇46考慮因素：1.被分離物質(zhì)帶何種電荷2.被分離物質(zhì)分子的大小大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量考慮因素：47根據(jù)分離過(guò)程的實(shí)驗(yàn)條件強(qiáng)酸強(qiáng)堿—應(yīng)用廣泛弱酸型—只能在堿性pH范圍內(nèi)使用弱堿型—只能在酸性pH范圍內(nèi)使用根據(jù)分離過(guò)程的實(shí)驗(yàn)條件48（二）緩沖液的選擇原則：避免使樣品變性;不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng);在此pH條件下,被分離物質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)與交換劑上的平衡離子相同;

需考慮離子交換劑的性質(zhì);不影響被分離組分的分析測(cè)定.（二）緩沖液的選擇49(三)洗脫劑

原則：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的離子或基團(tuán)改變pH或離子強(qiáng)度增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力洗脫方式：梯度洗脫(三)洗脫劑50(四)操作1.離子交換劑的處理:除去過(guò)小的顆粒消除雜質(zhì)轉(zhuǎn)化平衡離子,調(diào)節(jié)所需的pH2.裝柱3.上樣4.洗脫5.洗脫液的收集和檢測(cè)6.再生(四)操作51四、應(yīng)用

分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子四、應(yīng)用

分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子52離子交換層析法分離氨基酸及測(cè)定

離子交換層析法分離氨基酸及測(cè)定53[原理]

所用樣品為天冬氨酸和組氨酸的混合液，分別屬酸性氨基酸(pI2.77)、堿性氨基酸(pI7.59)，用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂Dowex50，在一定的洗脫條件下洗脫，將它們分離。利用氨基酸可與茚三酮反應(yīng)生成有色化合物進(jìn)行氨基酸鑒定。[原理]所用樣品為天冬氨酸和組氨酸的混合液，分54紫色物質(zhì)，用于α－氨基酸的比色測(cè)定和紙層析顯色與水含茚三酮的反應(yīng)：紫色物質(zhì)，用于α－氨基酸的比色測(cè)定和紙層析顯色與水含茚三酮的55

AspHispH4.2pH>10Asp56[器材]

1.

層析柱等2.

沸水浴[器材]1.

層析柱等57[試劑]

Dowex500.1mol/LNaOHpH4.2檸檬酸緩沖液樣品液：氨基酸混合液茚三酮混合液[試劑]Dowex5058[操作]

1、層析：將Dowex50裝柱后，用0.1mol/LNaOH清洗樹(shù)脂5分鐘。再用pH4.2檸檬酸鈉緩沖液平衡10分鐘。（方法同凝膠層析法）加樣5-6滴。當(dāng)樣品進(jìn)入樹(shù)脂后，加入pH4.2檸檬酸緩沖液洗脫加