食品微生物檢測課件

食品微生物檢測

實驗部分教材大綱食品微生物檢測

實驗部分教材大綱第一部分消毒第一部分消毒進(jìn)入無菌室前的準(zhǔn)備1.1實驗前放好需用的實驗器材及各種培養(yǎng)基，打開紫外燈消毒30－60min。1.2手部的消毒：進(jìn)入無菌室前，先用肥皂清洗雙手，在消毒水中浸泡雙手3min后用水沖洗。1.3進(jìn)入緩沖室：換鞋子或穿鞋套，戴口罩、帽子、手套，穿衣服（有風(fēng)淋室的，需在風(fēng)淋室轉(zhuǎn)動站立5min）。稱樣品2.1手部的消毒2.2鑷子、剪刀、勺子的消毒。2.3樣品包裝口的消毒（一個樣品換一把鑷子、剪刀或勺子）。進(jìn)入無菌室前的準(zhǔn)備實驗結(jié)束后的消毒3.1用過的實驗器材經(jīng)高溫消毒后再清洗。3.2實驗臺面用消毒水擦洗干凈。3.3換下的鞋套、口罩、帽子、衣服放入專用垃圾袋進(jìn)行消毒處理。3.4清洗雙手：先用肥皂清洗雙手，在消毒水中浸泡雙手3min后用水沖洗，再用肥皂清洗雙手。3.5打開紫外燈消毒30－60min。實驗結(jié)束后的消毒第二部分菌落總數(shù)測定第二部分菌落總數(shù)測定檢驗依據(jù)GB/T4789.2－2003菌落總數(shù)的定義食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、PH、需氧性質(zhì)等），所得1mL(g)檢樣中所含菌落的總數(shù)。設(shè)備和材料冰箱電子天平均質(zhì)器恒溫水浴鍋恒溫培養(yǎng)箱干燥箱架盤藥物天平滅菌吸管：1mL、10mL滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm滅菌剪刀、鑷子、勺子等酒精燈檢驗依據(jù)GB/T4789.2－2003培養(yǎng)基和試劑營養(yǎng)瓊脂0.85％滅菌生理鹽水75％酒精棉球培養(yǎng)基和試劑檢驗程序檢樣稀釋及培養(yǎng)1.1以無菌操作將檢樣25g（mL）剪碎放于含有225mL滅菌生理鹽水的塑料瓶內(nèi)，經(jīng)充分振搖做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置均質(zhì)器中處理。1.2用1mL滅菌吸管吸取1：10的稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液），振搖試管，混合均勻，做成1：100的稀釋液。1.3另取1mL滅菌吸管，按1.2操作方法，做10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。檢驗程序1.4根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2－3個適宜稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。1.5稀釋液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)及時將涼至46℃左右營養(yǎng)瓊脂（可放置46℃±1℃水浴鍋保溫）注入培養(yǎng)皿約15mL，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂注入加有1mL稀釋液滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。1.6待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。1.7作空白對照的作用瓊脂表面長菌說明空氣中帶菌，平皿邊上長菌說明平皿受到污染，瓊脂中間長菌說明稀釋液或瓊脂帶菌。1.4根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2菌落總數(shù)操作步驟25g(mL)樣品225mL0.85%滅菌生理鹽水1mL

1mL

1:10約15mL營養(yǎng)瓊脂吸取1mL

9mL0.85%

滅菌生理鹽水

1mL

1mL

1:100約15mL營養(yǎng)瓊脂36℃±1℃,培養(yǎng)48h±2h菌落總數(shù)操作步驟25g(mL)樣品225mL0.85%1mL菌落計數(shù)方法

做平板菌落計數(shù)時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平板的菌落數(shù)，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。菌落計數(shù)的報告3.1選取菌落數(shù)在30－300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。一個稀釋度使用兩個平板，應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)。若兩個平板中有一個平板有較大片狀菌落生長時，應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落生長不到平板的一半，而其余一半菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)，再采用兩個平板平均數(shù)作為該稀釋度的菌落數(shù)。平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界線），一條鏈可視為一個菌落計數(shù)。菌落計數(shù)方法3.2稀釋度的選擇3.2.1選擇平均菌落數(shù)在30－300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例1）。3.2.2若兩個稀釋度的平均菌落數(shù)均在30－300之間，則視兩者之比決定。若比值≤2，報告其平均數(shù)；若＞2，報告其中較小的數(shù)字（見表1中例2及例3）。3.2.3若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)（見表1中例4）。3.2.4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)（見表1中例5）。3.2.5若所有稀釋度均無菌落生長，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)見表1中例6）。3.2.6若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30－300之間，其中一部分大于300，一部分小于30時，按最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)（見表1中例7）。3.2稀釋度的選擇3.3菌落數(shù)的報告菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告；大于100時采用兩位有效數(shù)字：①小于5舍去，②大于5進(jìn)一位3.3菌落數(shù)的報告表1稀釋度的選擇及菌落數(shù)報告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)cfu/g（mL）報告方式cfu/g（mL）10-1

10-210-31多不可計16420—1640016000或1.6×104

2多不可計295461.63775038000或3.8×104

3多不可計271602.22710027000或2.7×1044多不可計多不可計313—313000310000或3.1×105

527115—270270或2.7×102

6000—＜1×10＜107多不可計30512—3050031000或3.1×104表1稀釋度的選擇及菌落數(shù)報告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩注意事項4.1每做一個稀釋度換用1支吸管。4.2每支吸管使用前在酒精燈上消毒，從吸管筒拿出來的吸管即使沒有用過，也不能放回吸管筒里。4.3在做稀釋度時，注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋度，蓋上試管蓋時在酒精燈上消毒，然后振搖試管，混合均勻。吸球不能對著吸管吹，沿管壁徐徐注入，以免帶入細(xì)菌，影響檢測結(jié)果。4.4將稀釋液注入平皿時，平皿蓋不宜離平皿底太遠(yuǎn)。從平皿筒拿出來的平皿即使沒有用過，也不能放回平皿筒里。4.5眼睛平視吸管凹液面的刻度為稀釋液的讀數(shù)。4.6手握吸管時吸管的尖端部向下。注意事項常見問題5.1吸管中稀釋液流出部分后堵塞5.2營養(yǎng)瓊脂注入后不能凝固（配制中出現(xiàn)的問題）常見問題第三部分霉菌和酵母菌計數(shù)第三部分霉菌和酵母菌計數(shù)檢驗依據(jù)GB/T4789.15－2003設(shè)備和材料冰箱電子天平均質(zhì)器恒溫水浴鍋恒溫培養(yǎng)箱干燥箱架盤藥物天平滅菌吸管：1mL、10mL滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm滅菌剪刀、鑷子、勺子等酒精燈培養(yǎng)基和試劑孟加拉紅0.85％滅菌蒸餾水75％酒精棉球檢驗依據(jù)GB/T4789.15－2003檢驗程序檢樣稀釋及培養(yǎng)1.1以無菌操作將檢樣25g（mL）剪碎放于含有225mL滅菌蒸餾水的塑料瓶內(nèi)，振搖30min，做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置均質(zhì)器中處理。1.2用10mL滅菌吸管吸取1：10的稀釋液10mL，注入滅菌試管內(nèi)，另用1mL滅菌吸管反復(fù)吹吸50次，使霉菌孢子充分散開。1.3用1mL滅菌吸管吸取1：10的稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌蒸餾水的試管內(nèi)，另用1mL滅菌吸管反復(fù)吹吸5次，做成1：100的稀釋液。檢驗程序檢樣稀釋及培養(yǎng)1.4另取1mL滅菌吸管，按1.3操作方法，做10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。1.5根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2－3個適宜稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。1.6稀釋液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)及時將涼至45℃左右的孟加拉紅（可放置45℃±1℃水浴鍋保溫）注入培養(yǎng)皿約15mL，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使混合均勻。同時將孟加拉紅注入加有1mL稀釋液滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。1.7待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置25℃－28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3d后開始觀察，共培養(yǎng)觀察5d。1.8作空白對照的作用瓊脂表面長菌說明空氣中帶菌，平皿邊上長菌說明平皿受到污染，瓊脂中間長菌說明稀釋液或瓊脂帶菌。1.4另取1mL滅菌吸管，按1.3操作方法，做10倍遞增稀釋霉菌和酵母菌計數(shù)操作步驟225mL滅菌蒸餾水25g(mL)樣品吸取10mL振搖30min9mL滅菌蒸餾水滅菌空試管吸取1mL1:10反復(fù)吹吸50次1:10反復(fù)吹吸5次1:1001mL1mL1mL1mL約15mL孟加拉紅約15mL孟加拉紅25℃~28℃,培養(yǎng)5d霉菌和酵母菌計數(shù)操作步驟225mL25g(mL)樣品吸取10霉菌和酵母菌計數(shù)方法選擇菌落數(shù)在10－150之間的平皿計數(shù)，同稀釋度的兩個平皿的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）檢樣中所含霉菌和酵母菌。稀釋度選擇及菌落報告方式可參考菌落總數(shù)測定。報告：每克（或毫升）檢樣中所含霉菌和酵母菌以cfu/g（mL）表示。注意事項4.1每做一個稀釋度換用1支吸管。4.2每支吸管使用前在酒精燈上消毒，從吸管筒拿出來的吸管即使沒有用過，也不能放回吸管筒里。4.3將稀釋液注入平皿時，平皿蓋不宜離平皿底太遠(yuǎn)。從平皿筒拿出來的平皿即使沒有用過，也不能放回平皿筒里。4.4眼睛平視吸管凹液面的刻度為稀釋液的讀數(shù)。4.5手握吸管時吸管的尖端部向下。常見問題5.1吸管中稀釋液流出部分后堵塞5.2孟加拉紅注入后不能凝固（配制中出現(xiàn)的問題）霉菌和酵母菌計數(shù)方法菌落總數(shù)測定、霉菌和酵母菌計數(shù)的區(qū)別兩者的操作步驟基本相似，區(qū)別在于以下幾點：稀釋度：在作遞增稀釋倍數(shù)時，菌落總數(shù)測定不能用吸球吸吹吸管，避免將空氣中的細(xì)菌帶入檢樣中，霉菌和酵母菌計數(shù)正好相反，用吸球反復(fù)吸吹吸管，使霉菌孢子充分散開。培養(yǎng)基不同：菌落總數(shù)測定用營養(yǎng)瓊脂，霉菌和酵母菌計數(shù)用孟加拉紅。稀釋度的選擇不同：菌落總數(shù)測定選擇平均菌落數(shù)在30－300之間的稀釋度，霉菌和酵母菌計數(shù)選擇平均菌落數(shù)在10－150之間的稀釋度。培養(yǎng)條件不同：菌落總數(shù)測定培養(yǎng)條件為36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，霉菌和酵母菌計數(shù)為25℃－28℃培養(yǎng)5d。菌落總數(shù)測定、霉菌和酵母菌計數(shù)的區(qū)別兩者的操作步驟基本相似，第四部分大腸菌群測定第四部分大腸菌群測定檢驗依據(jù)GB/T4789.3－2003大腸菌群的定義

一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人畜糞便。食品中大腸菌群數(shù)系以100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。設(shè)備和材料冰箱電子天平均質(zhì)器恒溫培養(yǎng)箱干燥箱架盤藥物天平滅菌吸管：1mL、10mL滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm滅菌剪刀、鑷子、勺子等酒精燈顯微鏡載玻片檢驗依據(jù)GB/T4789.3－2003培養(yǎng)基和試劑乳糖膽鹽發(fā)酵管伊紅美藍(lán)瓊脂平板乳糖發(fā)酵管0.85％滅菌生理鹽水75％酒精棉球革蘭氏染色液培養(yǎng)基和試劑檢驗程序檢樣稀釋：同菌落總數(shù)1.1、1.2、1.3操作步驟。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管。乳糖發(fā)酵試驗3.1將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，接種量在1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。3.2觀察現(xiàn)象：觀察乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)的玻璃小導(dǎo)管里是否有氣泡，有氣泡代表產(chǎn)氣。若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則報告為大腸菌群陰性，若有產(chǎn)氣的，則繼續(xù)接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板。

檢驗程序大腸菌群操作步驟125g(mL)樣品225mL0.85%滅菌生理鹽水吸取1mL

9mL0.85%

滅菌生理鹽水

各吸取10mL1:10各吸取1mL10mL雙料10mL雙料10mL雙料5mL單料5mL單料5mL單料各吸取1mL1:1005mL單料5mL單料5mL單料36℃±1℃,培養(yǎng)24h±2h大腸菌群操作步驟125g(mL)樣品225mL0.85%吸取分離培養(yǎng)4.1將產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。4.2觀察菌落形態(tài)，大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上：紫黑色有金屬光澤、圓形、中等大小、濕潤。若平板上出現(xiàn)上述菌落形態(tài)，則為可疑菌落。4.3挑取可疑菌落1－2個進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。4.3.1革蘭氏染色原理G+的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)不易脫色，呈現(xiàn)紫色。G-的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，脂類物質(zhì)含量高，用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出脫色，然后又被染上復(fù)染液的顏色，呈現(xiàn)紅色。4.3.2革蘭氏染色液有4種：結(jié)晶紫染色液(著色)、革蘭氏碘液(媒染)、95％乙醇(脫色)、沙黃復(fù)染液(著色)。分離培養(yǎng)4.3.3染色步驟：4.3.3.1從伊紅美藍(lán)瓊脂平板上挑取1－2個可疑菌落，涂在載玻片中央，在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。4.3.3.2滴加革蘭氏碘液，染1min，水洗。4.3.3.3滴加95％乙醇脫色，約30s，水洗。4.3.3.4滴加復(fù)染液，染1min，水洗，待干，鏡檢。4.3.3.5鏡檢：低倍鏡→高倍鏡→油鏡（滴加香柏油），結(jié)束后用二甲苯擦凈。4.3.4結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。4.3.3染色步驟：大腸菌群操作步驟2觀察九管結(jié)果不產(chǎn)氣大腸菌群陰性報告接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h革蘭氏染色鏡檢乳糖發(fā)酵管革蘭氏陽性革蘭氏陰性無芽胞桿菌大腸菌群陰性報告產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸菌群陽性報告大腸菌群陰性報告產(chǎn)氣36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h紫色紅色大腸菌群操作步驟2觀察九管結(jié)果不產(chǎn)氣大腸菌群陰性報告接種伊紅證實試驗

同時從伊紅美藍(lán)瓊脂平板上挑取1－2可疑菌落接種乳糖發(fā)酵管，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。觀察產(chǎn)氣情況。若革蘭氏染色鏡檢為陰性的無芽胞桿菌，同時乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。報告根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100mL（g）大腸菌群的MPN值（見GB/T4789.3－2003表1）。食品微生物檢測課件注意事項7.1檢查乳糖膽鹽發(fā)酵管和乳糖發(fā)酵管是否放玻璃小導(dǎo)管。7.2每做一個稀釋度換用1支吸管。7.3每支吸管使用前在酒精燈上消毒，從吸管筒拿出來的吸管即使沒有用過，也不能放回吸管筒里。7.4眼睛平視吸管凹液面的刻度為稀釋液的讀數(shù)。7.5手握吸管時吸管的尖端部向下。7.6吸球不能對著吸管吹。7.7每接種一根乳糖膽鹽發(fā)酵管，通過酒精燈消毒蓋口，振搖均勻。常見問題：吸管中稀釋液流出部分后堵塞。注意事項第五部分培養(yǎng)基的配制第五部分培養(yǎng)基的配制所有培養(yǎng)基用蒸餾水配制，經(jīng)高壓滅菌后使用。培養(yǎng)基的配制營養(yǎng)瓊脂單料、雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管伊紅美蘭瓊脂平板乳糖發(fā)酵管孟加拉紅0.85％滅菌生理鹽水可以直接倒入蒸餾水中，攪拌溶解，分裝。①先將蒸餾水煮到一定溫度，再將稱好的培養(yǎng)基倒入，搖勻,繼續(xù)煮沸溶解。②培養(yǎng)基稱量后暴露在空氣中容易發(fā)生潮解，倒入熱水中的量少于實際稱重的量，所以在實際稱重時根據(jù)損失的量適當(dāng)多稱少許。所有培養(yǎng)基用蒸餾水配制，經(jīng)高壓滅菌后使用。①先將蒸餾水煮到一培養(yǎng)基的保存條件

經(jīng)高壓滅菌后的培養(yǎng)基置4℃左右貯存，貯存時間夏季不超過7天，冬季不超過14天。注意事項1.在煮沸溶解培養(yǎng)基時，未溶解的培養(yǎng)基不能粘在玻璃器皿的底部，容易發(fā)生爆裂。2.配制乳糖膽鹽發(fā)酵管和乳糖發(fā)酵管時放玻璃小導(dǎo)管。培養(yǎng)基的保存條件第六部分報告第六部分報告食品微生物檢測

實驗部分教材大綱食品微生物檢測

實驗部分教材大綱第一部分消毒第一部分消毒進(jìn)入無菌室前的準(zhǔn)備1.1實驗前放好需用的實驗器材及各種培養(yǎng)基，打開紫外燈消毒30－60min。1.2手部的消毒：進(jìn)入無菌室前，先用肥皂清洗雙手，在消毒水中浸泡雙手3min后用水沖洗。1.3進(jìn)入緩沖室：換鞋子或穿鞋套，戴口罩、帽子、手套，穿衣服（有風(fēng)淋室的，需在風(fēng)淋室轉(zhuǎn)動站立5min）。稱樣品2.1手部的消毒2.2鑷子、剪刀、勺子的消毒。2.3樣品包裝口的消毒（一個樣品換一把鑷子、剪刀或勺子）。進(jìn)入無菌室前的準(zhǔn)備實驗結(jié)束后的消毒3.1用過的實驗器材經(jīng)高溫消毒后再清洗。3.2實驗臺面用消毒水擦洗干凈。3.3換下的鞋套、口罩、帽子、衣服放入專用垃圾袋進(jìn)行消毒處理。3.4清洗雙手：先用肥皂清洗雙手，在消毒水中浸泡雙手3min后用水沖洗，再用肥皂清洗雙手。3.5打開紫外燈消毒30－60min。實驗結(jié)束后的消毒第二部分菌落總數(shù)測定第二部分菌落總數(shù)測定檢驗依據(jù)GB/T4789.2－2003菌落總數(shù)的定義食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、PH、需氧性質(zhì)等），所得1mL(g)檢樣中所含菌落的總數(shù)。設(shè)備和材料冰箱電子天平均質(zhì)器恒溫水浴鍋恒溫培養(yǎng)箱干燥箱架盤藥物天平滅菌吸管：1mL、10mL滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm滅菌剪刀、鑷子、勺子等酒精燈檢驗依據(jù)GB/T4789.2－2003培養(yǎng)基和試劑營養(yǎng)瓊脂0.85％滅菌生理鹽水75％酒精棉球培養(yǎng)基和試劑檢驗程序檢樣稀釋及培養(yǎng)1.1以無菌操作將檢樣25g（mL）剪碎放于含有225mL滅菌生理鹽水的塑料瓶內(nèi)，經(jīng)充分振搖做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置均質(zhì)器中處理。1.2用1mL滅菌吸管吸取1：10的稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液），振搖試管，混合均勻，做成1：100的稀釋液。1.3另取1mL滅菌吸管，按1.2操作方法，做10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。檢驗程序1.4根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2－3個適宜稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。1.5稀釋液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)及時將涼至46℃左右營養(yǎng)瓊脂（可放置46℃±1℃水浴鍋保溫）注入培養(yǎng)皿約15mL，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂注入加有1mL稀釋液滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。1.6待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。1.7作空白對照的作用瓊脂表面長菌說明空氣中帶菌，平皿邊上長菌說明平皿受到污染，瓊脂中間長菌說明稀釋液或瓊脂帶菌。1.4根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2菌落總數(shù)操作步驟25g(mL)樣品225mL0.85%滅菌生理鹽水1mL

1mL

1:10約15mL營養(yǎng)瓊脂吸取1mL

9mL0.85%

滅菌生理鹽水

1mL

1mL

1:100約15mL營養(yǎng)瓊脂36℃±1℃,培養(yǎng)48h±2h菌落總數(shù)操作步驟25g(mL)樣品225mL0.85%1mL菌落計數(shù)方法

做平板菌落計數(shù)時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平板的菌落數(shù)，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。菌落計數(shù)的報告3.1選取菌落數(shù)在30－300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。一個稀釋度使用兩個平板，應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)。若兩個平板中有一個平板有較大片狀菌落生長時，應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落生長不到平板的一半，而其余一半菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)，再采用兩個平板平均數(shù)作為該稀釋度的菌落數(shù)。平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界線），一條鏈可視為一個菌落計數(shù)。菌落計數(shù)方法3.2稀釋度的選擇3.2.1選擇平均菌落數(shù)在30－300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例1）。3.2.2若兩個稀釋度的平均菌落數(shù)均在30－300之間，則視兩者之比決定。若比值≤2，報告其平均數(shù)；若＞2，報告其中較小的數(shù)字（見表1中例2及例3）。3.2.3若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)（見表1中例4）。3.2.4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)（見表1中例5）。3.2.5若所有稀釋度均無菌落生長，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)見表1中例6）。3.2.6若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30－300之間，其中一部分大于300，一部分小于30時，按最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)（見表1中例7）。3.2稀釋度的選擇3.3菌落數(shù)的報告菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告；大于100時采用兩位有效數(shù)字：①小于5舍去，②大于5進(jìn)一位3.3菌落數(shù)的報告表1稀釋度的選擇及菌落數(shù)報告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)cfu/g（mL）報告方式cfu/g（mL）10-1

10-210-31多不可計16420—1640016000或1.6×104

2多不可計295461.63775038000或3.8×104

3多不可計271602.22710027000或2.7×1044多不可計多不可計313—313000310000或3.1×105

527115—270270或2.7×102

6000—＜1×10＜107多不可計30512—3050031000或3.1×104表1稀釋度的選擇及菌落數(shù)報告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩注意事項4.1每做一個稀釋度換用1支吸管。4.2每支吸管使用前在酒精燈上消毒，從吸管筒拿出來的吸管即使沒有用過，也不能放回吸管筒里。4.3在做稀釋度時，注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋度，蓋上試管蓋時在酒精燈上消毒，然后振搖試管，混合均勻。吸球不能對著吸管吹，沿管壁徐徐注入，以免帶入細(xì)菌，影響檢測結(jié)果。4.4將稀釋液注入平皿時，平皿蓋不宜離平皿底太遠(yuǎn)。從平皿筒拿出來的平皿即使沒有用過，也不能放回平皿筒里。4.5眼睛平視吸管凹液面的刻度為稀釋液的讀數(shù)。4.6手握吸管時吸管的尖端部向下。注意事項常見問題5.1吸管中稀釋液流出部分后堵塞5.2營養(yǎng)瓊脂注入后不能凝固（配制中出現(xiàn)的問題）常見問題第三部分霉菌和酵母菌計數(shù)第三部分霉菌和酵母菌計數(shù)檢驗依據(jù)GB/T4789.15－2003設(shè)備和材料冰箱電子天平均質(zhì)器恒溫水浴鍋恒溫培養(yǎng)箱干燥箱架盤藥物天平滅菌吸管：1mL、10mL滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm滅菌剪刀、鑷子、勺子等酒精燈培養(yǎng)基和試劑孟加拉紅0.85％滅菌蒸餾水75％酒精棉球檢驗依據(jù)GB/T4789.15－2003檢驗程序檢樣稀釋及培養(yǎng)1.1以無菌操作將檢樣25g（mL）剪碎放于含有225mL滅菌蒸餾水的塑料瓶內(nèi)，振搖30min，做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置均質(zhì)器中處理。1.2用10mL滅菌吸管吸取1：10的稀釋液10mL，注入滅菌試管內(nèi)，另用1mL滅菌吸管反復(fù)吹吸50次，使霉菌孢子充分散開。1.3用1mL滅菌吸管吸取1：10的稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌蒸餾水的試管內(nèi)，另用1mL滅菌吸管反復(fù)吹吸5次，做成1：100的稀釋液。檢驗程序檢樣稀釋及培養(yǎng)1.4另取1mL滅菌吸管，按1.3操作方法，做10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。1.5根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2－3個適宜稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。1.6稀釋液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)及時將涼至45℃左右的孟加拉紅（可放置45℃±1℃水浴鍋保溫）注入培養(yǎng)皿約15mL，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使混合均勻。同時將孟加拉紅注入加有1mL稀釋液滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。1.7待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置25℃－28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3d后開始觀察，共培養(yǎng)觀察5d。1.8作空白對照的作用瓊脂表面長菌說明空氣中帶菌，平皿邊上長菌說明平皿受到污染，瓊脂中間長菌說明稀釋液或瓊脂帶菌。1.4另取1mL滅菌吸管，按1.3操作方法，做10倍遞增稀釋霉菌和酵母菌計數(shù)操作步驟225mL滅菌蒸餾水25g(mL)樣品吸取10mL振搖30min9mL滅菌蒸餾水滅菌空試管吸取1mL1:10反復(fù)吹吸50次1:10反復(fù)吹吸5次1:1001mL1mL1mL1mL約15mL孟加拉紅約15mL孟加拉紅25℃~28℃,培養(yǎng)5d霉菌和酵母菌計數(shù)操作步驟225mL25g(mL)樣品吸取10霉菌和酵母菌計數(shù)方法選擇菌落數(shù)在10－150之間的平皿計數(shù)，同稀釋度的兩個平皿的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）檢樣中所含霉菌和酵母菌。稀釋度選擇及菌落報告方式可參考菌落總數(shù)測定。報告：每克（或毫升）檢樣中所含霉菌和酵母菌以cfu/g（mL）表示。注意事項4.1每做一個稀釋度換用1支吸管。4.2每支吸管使用前在酒精燈上消毒，從吸管筒拿出來的吸管即使沒有用過，也不能放回吸管筒里。4.3將稀釋液注入平皿時，平皿蓋不宜離平皿底太遠(yuǎn)。從平皿筒拿出來的平皿即使沒有用過，也不能放回平皿筒里。4.4眼睛平視吸管凹液面的刻度為稀釋液的讀數(shù)。4.5手握吸管時吸管的尖端部向下。常見問題5.1吸管中稀釋液流出部分后堵塞5.2孟加拉紅注入后不能凝固（配制中出現(xiàn)的問題）霉菌和酵母菌計數(shù)方法菌落總數(shù)測定、霉菌和酵母菌計數(shù)的區(qū)別兩者的操作步驟基本相似，區(qū)別在于以下幾點：稀釋度：在作遞增稀釋倍數(shù)時，菌落總數(shù)測定不能用吸球吸吹吸管，避免將空氣中的細(xì)菌帶入檢樣中，霉菌和酵母菌計數(shù)正好相反，用吸球反復(fù)吸吹吸管，使霉菌孢子充分散開。培養(yǎng)基不同：菌落總數(shù)測定用營養(yǎng)瓊脂，霉菌和酵母菌計數(shù)用孟加拉紅。稀釋度的選擇不同：菌落總數(shù)測定選擇平均菌落數(shù)在30－300之間的稀釋度，霉菌和酵母菌計數(shù)選擇平均菌落數(shù)在10－150之間的稀釋度。培養(yǎng)條件不同：菌落總數(shù)測定培養(yǎng)條件為36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，霉菌和酵母菌計數(shù)為25℃－28℃培養(yǎng)5d。菌落總數(shù)測定、霉菌和酵母菌計數(shù)的區(qū)別兩者的操作步驟基本相似，第四部分大腸菌群測定第四部分大腸菌群測定檢驗依據(jù)GB/T4789.3－2003大腸菌群的定義

一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人畜糞便。食品中大腸菌群數(shù)系以100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。設(shè)備和材料冰箱電子天平均質(zhì)器恒溫培養(yǎng)箱干燥箱架盤藥物天平滅菌吸管：1mL、10mL滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm滅菌剪刀、鑷子、勺子等酒精燈顯微鏡載玻片檢驗依據(jù)GB/T4789.3－2003培養(yǎng)基和試劑乳糖膽鹽發(fā)酵管伊紅美藍(lán)瓊脂平板乳糖發(fā)酵管0.85％滅菌生理鹽水75％酒精棉球革蘭氏染色液培養(yǎng)基和試劑檢驗程序檢樣稀釋：同菌落總數(shù)1.1、1.2、1.3操作步驟。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管。乳糖發(fā)酵試驗3.1將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，接種量在1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。3.2觀察現(xiàn)象：觀察乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)的玻璃小導(dǎo)管里是否有氣泡，有氣泡代表產(chǎn)氣。若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則報告為大腸菌群陰性，若有產(chǎn)氣的，則繼續(xù)接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板。

檢驗程序大腸菌群操作步驟125g(mL)樣品225mL0.85%滅菌生理鹽水吸取1mL

9mL0.85%

滅菌生理鹽水

各吸取10mL1:10各吸取1mL10mL雙料10mL雙料10mL雙料5mL單料5mL單料5mL單料各吸取1mL1:1005mL單料5mL單料5mL單料36℃±1℃,培養(yǎng)24h±2h大腸菌群操作步驟125g(mL)樣品225mL0.85%吸取分離培養(yǎng)4.1將產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。4.2觀察菌落形態(tài)，大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上：紫黑色有金屬光澤、圓形、中等大小、濕潤。若平板上出現(xiàn)上述菌落形態(tài)，則為可疑菌落。4.3挑取可疑菌落1－2個進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。4.3.1革蘭氏染色原理G+的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)不易脫色，呈現(xiàn)紫色。G-的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，脂類物質(zhì)含量高，用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶