免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件

免疫學(xué)檢測(cè)新技術(shù)

及其臨床應(yīng)用

免疫學(xué)檢測(cè)新技術(shù)

及其臨床應(yīng)用主要內(nèi)容免疫學(xué)理論及技術(shù)研究和臨床免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)構(gòu)成重要免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹主要內(nèi)容免疫學(xué)理論及技術(shù)研究和臨床一、免疫學(xué)理論及技術(shù)

研究和臨床

一、免疫學(xué)理論及技術(shù)

研究和臨床

1796年，愛(ài)得華?琴納發(fā)明了牛痘疫苗從而保護(hù)人不得天花，WHO于1979年宣布天花滅絕。1796年，愛(ài)得華?琴納發(fā)明了牛痘疫苗從而保護(hù)人不得天花，W免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件72011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)BruceA.BeutlerBorninUSAJulesA.HoffmannBorninLuxembourgRalphM.SteinmanBorninCanada證實(shí)Toll基因編碼產(chǎn)物在識(shí)別病原微生物激活免疫反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用發(fā)現(xiàn)LPS受體：一種Toll樣受體發(fā)現(xiàn)樹(shù)突細(xì)胞可激活T細(xì)胞引發(fā)免疫應(yīng)答72011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)BruceA.Beutl傳染病預(yù)防疾病治療免疫診斷免疫學(xué)理論及技術(shù)研究的臨床意義傳染病預(yù)防免疫學(xué)理論及技術(shù)研究的臨床意義接種疫苗預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎?WHO

接種疫苗預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎?WHO免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件已批準(zhǔn)上市的細(xì)胞因子多肽藥物IFNα肝炎、白血病、AIDS、癌癥IFNγ類(lèi)風(fēng)關(guān)，感染性疾病，慢性肉芽腫，過(guò)敏性皮炎G-CSF化療導(dǎo)致的粒細(xì)胞減少癥、再障、自身骨髓移植GM-CSF化療導(dǎo)致的血細(xì)胞減少癥、再障、自身骨髓移植EPO慢性腎衰所致貧血、癌癥或癌癥化療所致貧血、失血后貧血IL-2癌癥、免疫缺陷、疫苗佐劑IFN-β多發(fā)性硬化癥IL-11放化療所致的血小板減少癥SCF與G-CSF聯(lián)合應(yīng)用于外周血干細(xì)胞移植EGF燒傷、潰瘍(外用藥，在中國(guó)應(yīng)用)βFGF燒傷、外周神經(jīng)炎(外用藥，在中國(guó)應(yīng)用)已批準(zhǔn)上市的細(xì)胞因子多肽藥物IFNα肝炎、白血病、AIDS、可溶性IL-1R(吸入劑）哮喘可溶性IL-1R(注射劑）急性髓樣白血病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可溶性IL-4R哮喘抗IL-4人源化抗體哮喘可溶性TNF-RII-Fc融合蛋白類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性心衰可溶性TNF-RI-Fc融合蛋白休克、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥人源化抗EGF-R2單抗乳腺癌抗TNF-α單抗局限性腸炎人源化抗IL-8抗體銀屑病細(xì)胞因子或其受體拮抗劑及其臨床應(yīng)用可溶性IL-1R(吸入劑）哮喘可溶性IL-1R(注射劑）急性二、免疫學(xué)技術(shù)構(gòu)成二、免疫學(xué)技術(shù)構(gòu)成基于抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)基于抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性一種抗原只能與其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體結(jié)合，這種抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的專(zhuān)一性稱(chēng)特異性?？赡嫘钥乖贵w主要通過(guò)分子表面的氫鍵、疏水鍵、靜電和范得華力非共價(jià)結(jié)合?？梢?jiàn)性在一定范圍內(nèi)，抗原抗體比例合適時(shí)，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)物。階段性抗原抗體特異性結(jié)合階段；反應(yīng)可見(jiàn)階段?？乖贵w反應(yīng)的特點(diǎn)特異性第一抗體（一抗）：用已知抗原免疫人或動(dòng)物后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生特異性抗體存在于血清中，這種抗體叫做一抗。第二抗體（二抗）：Ig具有同種型抗原特異性，將人Ig免疫動(dòng)物，或?qū)?dòng)物Ig免疫異種動(dòng)物可制備出抗抗體，又稱(chēng)二抗。第一抗體（一抗）：用已知抗原免疫人或動(dòng)物后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生特異性抗原抗體反應(yīng)類(lèi)型和檢測(cè)方法凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體參加的反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反應(yīng)類(lèi)型和檢測(cè)方法凝集反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)

凝集反應(yīng)（顆粒性抗原）

沉淀反應(yīng)（可溶性抗原）

補(bǔ)體參加的反應(yīng)：溶血空斑實(shí)驗(yàn)

免疫標(biāo)記技術(shù)直接凝集反應(yīng)玻片凝集：ABO血型鑒定試管凝集：肥達(dá)反應(yīng)間接凝集反應(yīng)：直接/間接Coombs試驗(yàn)間接凝集抑制反應(yīng)：免疫妊娠診斷試驗(yàn)單向免疫擴(kuò)散：定量雙向免疫擴(kuò)散：檢測(cè)復(fù)雜抗原抗體、半定量免疫電泳：血清蛋白及抗體成分分析免疫酶技術(shù)（酶標(biāo)記）ELISA免疫組化：以組織或細(xì)胞為抗原間接法:已知抗原測(cè)抗體夾心法:已知抗體測(cè)抗原免疫熒光技術(shù):熒光素標(biāo)記同位素標(biāo)記技術(shù):同位素標(biāo)記抗原抗體反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體參加的反應(yīng)免疫細(xì)胞的分離外周血（人）淋巴細(xì)胞分層液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞玻璃粘附法單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞尼龍毛、E花結(jié)淘選、磁珠、流式T細(xì)胞B細(xì)胞淘選、磁珠、流式T細(xì)胞亞群（利用T細(xì)胞表面CD分子）免疫細(xì)胞的分離外周血（人）淋巴細(xì)胞分層液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞玻璃粘附法免疫細(xì)胞功能測(cè)定淋巴細(xì)胞功能測(cè)定吞噬細(xì)胞功能測(cè)定T細(xì)胞增殖試驗(yàn)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：細(xì)胞毒試驗(yàn)3H-TdR摻入法MTT摻入法溶血空斑試驗(yàn)51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法形態(tài)學(xué)DNA-ladderTUNEL流式中性粒細(xì)胞趨化功能的測(cè)定中性粒細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定炭粒廓清試驗(yàn)雞紅細(xì)胞吞噬試驗(yàn)免疫細(xì)胞功能測(cè)定T細(xì)胞增殖試驗(yàn)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：細(xì)胞毒試驗(yàn)3H四、重要免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹四、重要免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹抗體作為工具的治療和檢測(cè)方法細(xì)胞的分離和功能分子功能檢測(cè)

免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件（一）抗體作為工具的治療和檢測(cè)方法

抗體技術(shù)

ELISAWestern-blot

免疫沉淀免疫組織化學(xué)（一）抗體作為工具的治療和檢測(cè)方法抗體技術(shù)1.抗體技術(shù)抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段第一代：多克隆抗血清第二代：細(xì)胞工程抗體（單克隆抗體）第三代：基因工程抗體

1.抗體技術(shù)抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段（1）單克隆抗體技術(shù)原理

(1)B細(xì)胞能產(chǎn)生抗體，但不易在體外培養(yǎng)；

(2)骨髓瘤細(xì)胞能在體內(nèi)、外無(wú)限增殖，但不能分泌抗體；

(3)兩者形成的雜交瘤細(xì)胞即能大量增殖，又能合成和分泌特異性抗體。（1）單克隆抗體技術(shù)原理單克隆抗體的制備

制備單克隆抗體的方法是用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤細(xì)胞變異株與脾臟的B細(xì)胞融合。采用HAT選擇性培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中加次黃嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶核苷），變異的瘤細(xì)胞不具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺與尿核苷酸單磷酸合成DNA，這一途徑又被氨基喋呤所阻斷，所以未融合的瘤細(xì)胞不可避免也要死亡。

B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)基中不能長(zhǎng)期生長(zhǎng)，一般于二周內(nèi)均死亡。融合的雜交瘤細(xì)胞由于脾淋巴細(xì)胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶，可以通過(guò)次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，因此雜交瘤細(xì)胞大量繁殖而被篩選出來(lái)。單克隆抗體的制備免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件單克隆抗體與常規(guī)抗血清的性質(zhì)比較

單克隆抗體與常規(guī)抗血清的性質(zhì)比較（2）基因工程抗體類(lèi)型嵌合抗體人源化抗體完全人源化抗體抗體分子片段新型抗體分子V區(qū)C區(qū)CDRVHCH1CH2CH3VLCLC端L鏈H鏈N端（2）基因工程抗體類(lèi)型V區(qū)C區(qū)CDRVHCH1CH2CH3V嵌合抗體（chimericantibody）：在基因水平上將小鼠的Ig可變區(qū)與人的Ig恒定區(qū)嵌合在一起。

人源化抗體（humanizedantibody）：又稱(chēng)CDR移植抗體（CDRgraftingantibody）即將針對(duì)某種抗原的鼠源特異性抗體超變區(qū)代替人的Ig超變區(qū)，所產(chǎn)生的抗體幾乎為人源的。鼠抗體人-鼠嵌合抗體

人源化抗體嵌合抗體（chimericantibody）：在基因水平上完全人源化抗體完全人源化抗體是指將人類(lèi)抗體基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類(lèi)編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動(dòng)物中，使動(dòng)物表達(dá)人類(lèi)抗體，達(dá)到抗體全人源化的目的。方法：噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、基因工程小鼠制備法、轉(zhuǎn)染色體小鼠、抗體工程藥物標(biāo)聯(lián)及增效技術(shù)完全人源化抗體抗體分子片段：抗體分子的抗原結(jié)合部位局限在可變區(qū)組成的Fv段,保留抗體上的抗原特異性結(jié)合區(qū)域,構(gòu)建無(wú)Fc段、分子量較小、具抗原結(jié)合功能的分子片段的小分子抗體,其具有易于穿透血管壁和組織屏障進(jìn)入病灶,有利于腫瘤的診斷和治療,免疫原性強(qiáng),避免了Fc段與無(wú)關(guān)Fc受體結(jié)合所帶來(lái)的副作用,可作為載體分子偶聯(lián)多種活性蛋白基因如酶、毒素等用于疾病的導(dǎo)向性治療,且不需進(jìn)行糖基化修飾,可在大腸桿菌中表達(dá)等特點(diǎn)。從而可改善其抗體的藥代動(dòng)力學(xué)特性,并適合于臨床的應(yīng)用。

抗體分子片段：抗體分子的抗原結(jié)合部位局限在可變區(qū)組成的Fv①單鏈抗體（singlechainFv，scFv）

②二硫鍵穩(wěn)定的Fv(disulfide-stabilizedFv，ds-Fv)ds-FvscFvVHVLVLVHds-FvscFvVHVLVLVH③單域抗體（singledomainantibody）及分子識(shí)別單位（molecularrecognitionunit,MRU）即單個(gè)V區(qū)抗體。④多價(jià)抗體（multivalenantibody）和多特異抗體（mulit-specificantibody）是指含有多個(gè)共價(jià)結(jié)合的Fv，具有一種或多種特異性的基因工程抗體。

多價(jià)FvFv多特異Fv③單域抗體（singledomainantibody）及新型抗體分子將抗體分子的部分片段與抗體無(wú)關(guān)的序列相連接，或利用其可變區(qū)特異結(jié)合抗原特性的同時(shí)發(fā)揮其它的生物學(xué)活性；或利用Ig分子的恒定區(qū)某些功能特點(diǎn)來(lái)加強(qiáng)與其結(jié)合的功能分子生物活性。

Fc新型抗體分子Fc抗原化抗體（antigenantibody,AgAb）將具有編碼蛋白抗原表位的抗原基因片段植入抗體的超變區(qū)中，使肽鏈接近天然構(gòu)象，可模擬抗原分子使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體?？乖贵w（antigenantibody,AgAb）AphagemidvectorPhagemidvectorcontainingaleadersequence,afragmentofthegeneexpressingphagecoatprotein3andM13originofreplication.基因工程抗體的獲得常規(guī)的基因重組、表達(dá)技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)AphagemidvectorPhagemidvect免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件單克隆抗體的臨床應(yīng)用

所治療的疾?。耗[瘤、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、器官移植、感染、心血管疾病等針對(duì)的抗原：細(xì)胞膜分子（CD分子、膜受體及粘附分子、腫瘤相關(guān)抗原）、細(xì)胞因子、獨(dú)特型、病毒單克隆抗體的臨床應(yīng)用免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件帕尼單抗（Panitumumab），即維克替比（Vectibix），安進(jìn)公司帕尼單抗（Panitumumab），免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件國(guó)內(nèi)已經(jīng)獲批生產(chǎn)的單抗產(chǎn)品公司名稱(chēng)商品名通用名適應(yīng)癥武漢生物制品研究所

注射用抗人T細(xì)胞CD3鼠單抗器官移植排異東莞宏逸士生物技術(shù)藥業(yè)

抗人白細(xì)胞介素/8單克隆抗體乳膏銀屑病恩博克大連亞維藥業(yè)

抗人白細(xì)胞介素/8單克隆抗體乳膏銀屑病上海中信國(guó)健藥業(yè)益賽普注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體/抗體融合蛋白類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等上海美恩生物技術(shù)唯美生碘[131I]腫瘤細(xì)胞核人鼠嵌合單克隆抗體注射液肝癌治療百泰生物藥業(yè)泰欣生尼妥珠單抗注射液結(jié)直腸癌上海賽金生物醫(yī)藥強(qiáng)克注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體/抗體融合蛋白強(qiáng)直性脊柱炎上海中信國(guó)健藥業(yè)健尼哌重組抗CD25人源化單克隆抗體注射液抗移植排斥國(guó)內(nèi)已經(jīng)獲批生產(chǎn)的單抗產(chǎn)品公司名稱(chēng)商品名通用名適應(yīng)癥武2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）將已知的抗原或抗體吸附于聚苯乙烯反應(yīng)板表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。通過(guò)級(jí)聯(lián)放大作用，酶催化底物顯色可進(jìn)行定性、定量分析微量的抗體或抗原。常用于標(biāo)記的酶為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）。靈敏度高，特異性好，操作簡(jiǎn)單，程序規(guī)范化。廣泛用于臨床疾病診斷。2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）將已知的抗原或抗體吸附于間接ELISA夾心ELISA競(jìng)爭(zhēng)ELISA左圖：酶標(biāo)板、移液器；右圖：酶標(biāo)儀間接ELISA左圖：酶標(biāo)板、移液器；右圖：酶標(biāo)儀間接ELISA：用于檢測(cè)液相中的抗體間接ELISA：用于檢測(cè)液相中的抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA：用來(lái)測(cè)定小分子抗原

夾心ELISA：測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原競(jìng)爭(zhēng)ELISA：用來(lái)測(cè)定小分子抗原

夾心ELISA：測(cè)定二價(jià)3.免疫印跡法（Western-blot）先將抗原經(jīng)SDS電泳分開(kāi)，再將分開(kāi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，然后放入含有抗體的液體中，洗去未結(jié)合抗體，再加標(biāo)記的二抗，通過(guò)顯色或發(fā)光顯示結(jié)果。3.免疫印跡法（Western-blot）先將抗原經(jīng)SDS免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件4.免疫沉淀法某些情況下，凝膠分離和印跡過(guò)程中抗原會(huì)降解，有些抗原表位會(huì)破壞，無(wú)法和特異抗體結(jié)合，此時(shí)，用免疫沉淀法可鑒定與抗體結(jié)合的抗原。該技術(shù)可用于可溶性抗原，也可用于細(xì)胞表面抗原的分析。待檢抗原用同位素標(biāo)記，加入抗體，使兩者特異結(jié)合，再加入共沉淀試劑，如proA等，使抗原抗體復(fù)合物沉淀下來(lái)，電泳后，固定膠經(jīng)放射自顯影，顯現(xiàn)特異標(biāo)記抗原所在的位置。4.免疫沉淀法某些情況下，凝膠分離和印跡過(guò)程中抗原會(huì)降解，免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件5.免疫組織化學(xué)用標(biāo)記的已知抗體與組織或細(xì)胞表面抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對(duì)抗原進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)的技術(shù)。常用方法：酶免疫組化（HRP等）免疫熒光技術(shù)（FITC、PE等）免疫金組化（膠體金）免疫電鏡技術(shù)（鐵蛋白、膠體金等）5.免疫組織化學(xué)用標(biāo)記的已知抗體與組織或細(xì)胞表面抗原發(fā)生反間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體（Hep2細(xì)胞）間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體（Hep2細(xì)胞）

免疫細(xì)胞的分離Ficoll的應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù)抗原特異性T細(xì)胞系的建立（二）細(xì)胞的分離和功能免疫細(xì)胞的分離（二）細(xì)胞的分離和功能

免疫細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞增殖的檢測(cè)：3H-TdR摻入法、CFSE效應(yīng)細(xì)胞測(cè)定：ELISPOT細(xì)胞毒試驗(yàn)Tetramer技術(shù)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：DNALadder、TUNEL、流式細(xì)胞技術(shù)（二）細(xì)胞的分離和功能免疫細(xì)胞功能測(cè)定（二）細(xì)胞的分離和功能1.淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）分離血細(xì)胞將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液（聚蔗糖-泛影葡胺）中即可配制成密度合適的分層液。不同動(dòng)物血中的單個(gè)核細(xì)胞對(duì)分離液的密度要求各不相同。水平式離心后，離心管中會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)不同層次的液體和細(xì)胞帶。BeforecentrifugeAftercentrifugemononuclearcells1.淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）分離血細(xì)胞將適量340g2.免疫磁珠分離技術(shù)將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)在磁性微珠上，與細(xì)胞懸液作用后置于磁場(chǎng)中，借磁力的作用將磁珠結(jié)合的細(xì)胞分開(kāi)。2.免疫磁珠分離技術(shù)將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)在磁性微免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件3.流式細(xì)胞技術(shù)3.流式細(xì)胞技術(shù)基本概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡(jiǎn)稱(chēng)FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性，并加以定量的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量基本概念原理原理流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)極短時(shí)間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，只要標(biāo)本中的細(xì)胞數(shù)量足夠，流式細(xì)胞儀（Flowcytometer）可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個(gè)細(xì)胞的速率進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量的細(xì)胞總數(shù)可達(dá)數(shù)千、數(shù)萬(wàn)乃至數(shù)百萬(wàn)個(gè)?？赏瑫r(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多種特征，當(dāng)同時(shí)用多種分子探針，如用不同熒光素標(biāo)記的不同單克隆抗體進(jìn)行多色熒光染色，通過(guò)流式細(xì)胞分析，即可獲得單細(xì)胞的多種信息，使細(xì)胞亞群的識(shí)別、計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。定性或定量分析細(xì)胞：通過(guò)熒光染色對(duì)單細(xì)胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達(dá)量、酶活性以及細(xì)胞的功能等均可進(jìn)行單細(xì)胞水平的定性與定量分析強(qiáng)大的分選功能，在分析的同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用1.淋巴細(xì)胞免疫分型

淋巴細(xì)胞亞群分析2.細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)3.免疫功能和免疫調(diào)控的研究淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化檢測(cè)細(xì)胞因子的檢測(cè)CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞CD4/CD8分析(HIV的診斷與研究)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用PE-CD19，F(xiàn)ITC-CD3抗體檢測(cè)淋巴細(xì)胞表型PE-CD19，F(xiàn)ITC-CD3抗體檢測(cè)淋巴細(xì)胞表型其他應(yīng)用：如細(xì)胞凋亡的分析、血液病、腫瘤及其基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)、干細(xì)胞研究等。其他應(yīng)用：4.T細(xì)胞系的建立4.T細(xì)胞系的建立5.細(xì)胞增殖的檢測(cè)：3H-TdR摻入法、CFSE觀察在有絲分裂原（PHA、ConA）或特異性抗原刺激下T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，測(cè)定細(xì)胞免疫功能。用3H-TdR法測(cè)T細(xì)胞增殖。5.細(xì)胞增殖的檢測(cè)：3H-TdR摻入法、CFSE觀察在有絲3H-TdR摻入法3H-TdR摻入法CFSE：羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-car-boxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFSE)是一種可穿過(guò)細(xì)胞膜的熒光染料,具有與細(xì)胞結(jié)合特異性的琥珀酰亞胺酯基團(tuán)與具有非酶促水解作用的羧基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)結(jié)合在一起可使CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。細(xì)胞經(jīng)CFSE染色后,在分裂增殖的過(guò)程中,標(biāo)記的CFSE可平均分配到子代細(xì)胞中,使熒光在細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中被逐漸稀釋,因而熒光強(qiáng)度逐漸減弱。即在1個(gè)增殖的細(xì)胞群中,各連續(xù)傳代細(xì)胞以熒光強(qiáng)度的1/2而遞減為特征。CFSE廣泛應(yīng)用于淋巴細(xì)胞的增殖試驗(yàn)中。此外,它還可應(yīng)用于細(xì)胞移植、細(xì)胞分裂周期的估算及細(xì)胞分選等方面。CFSE：羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-car-免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件6.效應(yīng)細(xì)胞測(cè)定：ELISPOT產(chǎn)生特異抗體的單個(gè)B細(xì)胞或分泌特異細(xì)胞因子的單個(gè)T細(xì)胞通過(guò)ELISPOT測(cè)定。測(cè)定抗體生成細(xì)胞，將淋巴細(xì)胞加入抗原致敏的板中。產(chǎn)生的特異性抗體即與抗體產(chǎn)生細(xì)胞鄰近的抗原發(fā)生結(jié)合。利用偶聯(lián)在抗免疫球蛋白上的酶和顯色劑，結(jié)合抗體的斑點(diǎn)即可被檢測(cè)。測(cè)定細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的板用抗細(xì)胞因子抗體包被，捕獲的細(xì)胞因子用酶標(biāo)記的抗細(xì)胞因子不同表位的抗體來(lái)測(cè)定。6.效應(yīng)細(xì)胞測(cè)定：ELISPOT產(chǎn)生特異抗體的單個(gè)B細(xì)胞或免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件7.細(xì)胞毒試驗(yàn)

CTL細(xì)胞通常測(cè)定它們裂解靶細(xì)胞的能力（如病毒感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等）。靶細(xì)胞裂解可由鉻釋放試驗(yàn)測(cè)定。靶細(xì)胞和51Cr一起孵育，51Cr被攝入靶細(xì)胞與蛋白結(jié)合。孵育后，把靶細(xì)胞轉(zhuǎn)至培養(yǎng)板與效應(yīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)4～16小時(shí)，取出上清，測(cè)量被效應(yīng)細(xì)胞裂解的靶細(xì)胞釋放的51Cr量。7.細(xì)胞毒試驗(yàn)

CTL細(xì)胞通常測(cè)定它們裂解靶細(xì)胞的能力（如鉻釋放細(xì)胞毒試驗(yàn)鉻釋放細(xì)胞毒試驗(yàn)8.Tetramer技術(shù)

Tetramer技術(shù)可以在離體細(xì)胞中測(cè)定抗原特異的CTL細(xì)胞，而無(wú)需體外擴(kuò)增。TCR識(shí)別的MHC-肽復(fù)合物直接染色抗原特異T細(xì)胞。TCR與MHC-肽復(fù)合物親和力低，迅速的解離無(wú)法進(jìn)行直接染色。帶有4個(gè)MHC-肽復(fù)合物的MHC四聚體可極大地增加對(duì)TCR的親和力。將適當(dāng)?shù)腗HC分子與一個(gè)肽段（BSP）融合，可作為生物素的底物，MHC-BSP和β2微球蛋白在E.coli中表達(dá)，與CTL的特異表位肽段混合，形成的MHC-肽段復(fù)合物被純化獲取。生物素化的復(fù)合物與熒光標(biāo)記的親和素以4:1比例混合產(chǎn)生四聚體。這些標(biāo)記的四聚體與抗原特異CTL結(jié)合，通過(guò)FACS檢測(cè)。8.Tetramer技術(shù)

Tetramer技術(shù)可以在離體細(xì)免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件9.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死是兩個(gè)不同的過(guò)程細(xì)胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學(xué)檢查L(zhǎng)adders實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢查與凋亡相關(guān)的病理過(guò)程HIV自身免疫性疾病腫瘤9.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死是兩個(gè)不同的過(guò)程細(xì)胞凋亡的生理意義在于：確保細(xì)胞正常發(fā)育和生長(zhǎng)；維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；細(xì)胞發(fā)揮積極的防御功能。細(xì)胞凋亡和許多疾病密切相關(guān)：細(xì)胞凋亡不足：如腫瘤和自身免疫?。患?xì)胞凋亡過(guò)度：如心肌缺血、心力衰竭、神經(jīng)元退行性疾病和病毒感染；凋亡不足與過(guò)度并存：如動(dòng)脈粥樣硬化。細(xì)胞凋亡的生理意義在于：細(xì)胞凋亡的主要表現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酶改變：Caspase-3活化細(xì)胞膜不對(duì)稱(chēng)性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI細(xì)胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實(shí)驗(yàn)凋亡相關(guān)蛋白：FasBcl-2細(xì)胞凋亡的主要表現(xiàn)(1)DNAladder凋亡細(xì)胞DNA可被核酸酶在核小體單位之間隨機(jī)切斷，產(chǎn)生180~200bp及其倍數(shù)的寡核苷酸片段，在瓊脂糖電泳中呈現(xiàn)階梯DNA區(qū)帶圖譜。(1)DNAladder凋亡細(xì)胞DNA可被核酸酶在核小體免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-biotinnickendlabeling)在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxyribonucleotidyl,TdT）和生物素標(biāo)記的核苷酸（dUTP），TdT能在游離的DNA3’端缺口連接標(biāo)記的核苷酸，利用生物素-親和素-酶（熒光）放大系統(tǒng)，在DNA斷裂處顯色，可標(biāo)示凋亡細(xì)胞。(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-b免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件(3)

流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡凋亡細(xì)胞因核斷裂，呈亞二倍體，用FACS分析亞二倍體數(shù)目，可指示細(xì)胞凋亡程度；因凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，膜磷脂成分暴露，可與熒光標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白（AnnexinV)結(jié)合，用FACS分析，可檢測(cè)懸浮細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的頻率。PI-Fluorescence#Events正常G0/G1期細(xì)胞(3)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡凋亡細(xì)胞因核斷裂，呈亞二倍體PIAnnexinV-FITCPIAnnexinV-FITC（三）分子功能檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因KnockoutRNAi技術(shù)（三）分子功能檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將目的基因（或基因組片段）用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中，使目的基因整合到基因組中，然后將此受精卵或胚胎細(xì)胞再植入受體動(dòng)物的輸卵管（或子宮）中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將目的基因（或基因組片段）用顯微注射等方法注方法顯微注射法胚胎干細(xì)胞法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法方法顯微注射法對(duì)基因組織或階段特異表達(dá)的研究通過(guò)新表型，發(fā)現(xiàn)基因的新功能通過(guò)突變表型，發(fā)現(xiàn)新基因用于只在胚胎期才表達(dá)的基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究建立外源基因表達(dá)、調(diào)控的動(dòng)物模型對(duì)遺傳疾病的研究建立人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型,進(jìn)而研究這些疾病的發(fā)病機(jī)理及治療方法

動(dòng)物新品種的培育作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器應(yīng)用對(duì)基因組織或階段特異表達(dá)的研究應(yīng)用2.基因敲除基因敲除(Geneknockout)是借助分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物胚胎學(xué)的方法,通過(guò)胚胎干細(xì)胞（ES）這一特殊的中間環(huán)節(jié)將小鼠的正常功能基因的編碼區(qū)破壞,藉以揭示基因功能最直接的手段之一,因此成為后基因組時(shí)代的重要研究方法和內(nèi)容。通過(guò)DNA同源重組，使得ES細(xì)胞特定的內(nèi)源基因被破壞而造成其功能喪失，然后通過(guò)ES細(xì)胞介導(dǎo)得到該基因喪失的小鼠模型的過(guò)程。迄今為止,只有小鼠干細(xì)胞的建系方法最成熟、效果最穩(wěn)定,因此小鼠是目前基因敲除研究的唯一的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。2.基因敲除基因敲除(Geneknockout)是借免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件意義基因敲除與多種疾病的研究基因敲除與生物制藥意義基因敲除與多種疾病的研究3.RNAiRNAi是近年來(lái)才發(fā)現(xiàn)的一種古老的、保守的生物途徑，是生物體適應(yīng)外界環(huán)境、調(diào)控基因表達(dá)、防止外來(lái)遺傳因子入侵的重要機(jī)制，具有重大的生物學(xué)意義。

RNAi現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，被《Science》評(píng)為2002年最重大科技突破。2006年的Nobel醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)授予了RNAi的提出者AndrewFire和CraigMello，從發(fā)現(xiàn)到獲獎(jiǎng)僅8年時(shí)間。隨著對(duì)RNAi機(jī)制研究的深入和RNAi技術(shù)的不斷完善，RNAi有望成為治療病毒感染性疾病的新方法。3.RNAiRNAi是近年來(lái)才發(fā)現(xiàn)的一種古老的、保守的生物第一步（起始階段）是較長(zhǎng)dsRNA在ATP參與下被RNaseⅢ樣的特異核酸酶切割加工成21~23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA的兩條單鏈末端為5’－磷酸和3’－羥基，且3’端均有２~3個(gè)突出的核苷酸。果蠅中的RNaseⅢ樣核酸酶稱(chēng)為Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域。Dicer的類(lèi)似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲(chóng)及哺乳動(dòng)物等機(jī)體中被發(fā)現(xiàn)。

RNAi的作用機(jī)制第一步（起始階段）是較長(zhǎng)dsRNA在ATP參與下被RNase第二步（效應(yīng)階段）是siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶等多種成分組成?；罨腞ISC在單鏈siRNA引導(dǎo)下識(shí)別互補(bǔ)的mRNA，并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對(duì)應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而干擾基因表達(dá)。

第二步（效應(yīng)階段）是siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶應(yīng)用基因治療：RNAi作用的高度特異性有可能特異地抑制致病的突變等位基因，但又不影響正常的等位基因。腫瘤的基因治療：腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控異常的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單個(gè)癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng)，而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對(duì)這一序列的dsRNA分子，只導(dǎo)入一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)沉默。應(yīng)用基因治療：RNAi作用的高度特異性有可能特異地抑制致病研究基因的功能：由于RNAi可以特異性抑制特定的基因，獲得功能喪失，因此可用于功能基因組的研究（類(lèi)似Geneknockout)。防御病毒的感染：RNAi具有對(duì)抗侵入性遺傳因子（如病毒、轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)基因）的作用、打破其復(fù)制循環(huán)、減弱或消除其基因毒性作用。由于RNAi也存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，RNAi或許可被利用來(lái)治療病毒性疾病。研究基因的功能：由于RNAi可以特異性抑制特定的基因，獲得考試題1.分別舉自身免疫病實(shí)例闡述Th細(xì)胞、B細(xì)胞和CTL在組織損傷中的作用。2.何謂宿主抗移植物反應(yīng)？闡述其臨床分型及其發(fā)生機(jī)制？3.試述單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用及其對(duì)免疫學(xué)發(fā)展的影響。4.考試（應(yīng)激反應(yīng)）后學(xué)生容易患感冒等病毒感染性疾病，（1）請(qǐng)運(yùn)用免疫學(xué)知識(shí)和內(nèi)分泌知識(shí)推測(cè)其原因，（2）檢測(cè)哪些指標(biāo)可以證明你的推測(cè)？5.任選一種已在臨床上廣泛使用的細(xì)胞因子，說(shuō)明其應(yīng)用范圍及作用機(jī)制。6.腫瘤免疫的基本特征是什么？答題說(shuō)明：請(qǐng)回答如下問(wèn)題，并將答案以手寫(xiě)體完成于A4紙上（不可打?。?，注明姓名、學(xué)號(hào)和班級(jí)。答卷10月11日前交到校本部階平樓292或291室?？荚囶}1.分別舉自身免疫病實(shí)例闡述Th細(xì)胞、B細(xì)胞和CTL免疫學(xué)檢測(cè)新技術(shù)

及其臨床應(yīng)用

免疫學(xué)檢測(cè)新技術(shù)

及其臨床應(yīng)用主要內(nèi)容免疫學(xué)理論及技術(shù)研究和臨床免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)構(gòu)成重要免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹主要內(nèi)容免疫學(xué)理論及技術(shù)研究和臨床一、免疫學(xué)理論及技術(shù)

研究和臨床

一、免疫學(xué)理論及技術(shù)

研究和臨床

1796年，愛(ài)得華?琴納發(fā)明了牛痘疫苗從而保護(hù)人不得天花，WHO于1979年宣布天花滅絕。1796年，愛(ài)得華?琴納發(fā)明了牛痘疫苗從而保護(hù)人不得天花，W免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件1082011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)BruceA.BeutlerBorninUSAJulesA.HoffmannBorninLuxembourgRalphM.SteinmanBorninCanada證實(shí)Toll基因編碼產(chǎn)物在識(shí)別病原微生物激活免疫反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用發(fā)現(xiàn)LPS受體：一種Toll樣受體發(fā)現(xiàn)樹(shù)突細(xì)胞可激活T細(xì)胞引發(fā)免疫應(yīng)答72011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)BruceA.Beutl傳染病預(yù)防疾病治療免疫診斷免疫學(xué)理論及技術(shù)研究的臨床意義傳染病預(yù)防免疫學(xué)理論及技術(shù)研究的臨床意義接種疫苗預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎?WHO

接種疫苗預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎?WHO免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件已批準(zhǔn)上市的細(xì)胞因子多肽藥物IFNα肝炎、白血病、AIDS、癌癥IFNγ類(lèi)風(fēng)關(guān)，感染性疾病，慢性肉芽腫，過(guò)敏性皮炎G-CSF化療導(dǎo)致的粒細(xì)胞減少癥、再障、自身骨髓移植GM-CSF化療導(dǎo)致的血細(xì)胞減少癥、再障、自身骨髓移植EPO慢性腎衰所致貧血、癌癥或癌癥化療所致貧血、失血后貧血IL-2癌癥、免疫缺陷、疫苗佐劑IFN-β多發(fā)性硬化癥IL-11放化療所致的血小板減少癥SCF與G-CSF聯(lián)合應(yīng)用于外周血干細(xì)胞移植EGF燒傷、潰瘍(外用藥，在中國(guó)應(yīng)用)βFGF燒傷、外周神經(jīng)炎(外用藥，在中國(guó)應(yīng)用)已批準(zhǔn)上市的細(xì)胞因子多肽藥物IFNα肝炎、白血病、AIDS、可溶性IL-1R(吸入劑）哮喘可溶性IL-1R(注射劑）急性髓樣白血病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可溶性IL-4R哮喘抗IL-4人源化抗體哮喘可溶性TNF-RII-Fc融合蛋白類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性心衰可溶性TNF-RI-Fc融合蛋白休克、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥人源化抗EGF-R2單抗乳腺癌抗TNF-α單抗局限性腸炎人源化抗IL-8抗體銀屑病細(xì)胞因子或其受體拮抗劑及其臨床應(yīng)用可溶性IL-1R(吸入劑）哮喘可溶性IL-1R(注射劑）急性二、免疫學(xué)技術(shù)構(gòu)成二、免疫學(xué)技術(shù)構(gòu)成基于抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)基于抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性一種抗原只能與其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體結(jié)合，這種抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的專(zhuān)一性稱(chēng)特異性?？赡嫘钥乖贵w主要通過(guò)分子表面的氫鍵、疏水鍵、靜電和范得華力非共價(jià)結(jié)合?？梢?jiàn)性在一定范圍內(nèi)，抗原抗體比例合適時(shí)，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)物。階段性抗原抗體特異性結(jié)合階段；反應(yīng)可見(jiàn)階段?？乖贵w反應(yīng)的特點(diǎn)特異性第一抗體（一抗）：用已知抗原免疫人或動(dòng)物后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生特異性抗體存在于血清中，這種抗體叫做一抗。第二抗體（二抗）：Ig具有同種型抗原特異性，將人Ig免疫動(dòng)物，或?qū)?dòng)物Ig免疫異種動(dòng)物可制備出抗抗體，又稱(chēng)二抗。第一抗體（一抗）：用已知抗原免疫人或動(dòng)物后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生特異性抗原抗體反應(yīng)類(lèi)型和檢測(cè)方法凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體參加的反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反應(yīng)類(lèi)型和檢測(cè)方法凝集反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)

凝集反應(yīng)（顆粒性抗原）

沉淀反應(yīng)（可溶性抗原）

補(bǔ)體參加的反應(yīng)：溶血空斑實(shí)驗(yàn)

免疫標(biāo)記技術(shù)直接凝集反應(yīng)玻片凝集：ABO血型鑒定試管凝集：肥達(dá)反應(yīng)間接凝集反應(yīng)：直接/間接Coombs試驗(yàn)間接凝集抑制反應(yīng)：免疫妊娠診斷試驗(yàn)單向免疫擴(kuò)散：定量雙向免疫擴(kuò)散：檢測(cè)復(fù)雜抗原抗體、半定量免疫電泳：血清蛋白及抗體成分分析免疫酶技術(shù)（酶標(biāo)記）ELISA免疫組化：以組織或細(xì)胞為抗原間接法:已知抗原測(cè)抗體夾心法:已知抗體測(cè)抗原免疫熒光技術(shù):熒光素標(biāo)記同位素標(biāo)記技術(shù):同位素標(biāo)記抗原抗體反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體參加的反應(yīng)免疫細(xì)胞的分離外周血（人）淋巴細(xì)胞分層液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞玻璃粘附法單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞尼龍毛、E花結(jié)淘選、磁珠、流式T細(xì)胞B細(xì)胞淘選、磁珠、流式T細(xì)胞亞群（利用T細(xì)胞表面CD分子）免疫細(xì)胞的分離外周血（人）淋巴細(xì)胞分層液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞玻璃粘附法免疫細(xì)胞功能測(cè)定淋巴細(xì)胞功能測(cè)定吞噬細(xì)胞功能測(cè)定T細(xì)胞增殖試驗(yàn)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：細(xì)胞毒試驗(yàn)3H-TdR摻入法MTT摻入法溶血空斑試驗(yàn)51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法形態(tài)學(xué)DNA-ladderTUNEL流式中性粒細(xì)胞趨化功能的測(cè)定中性粒細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定炭粒廓清試驗(yàn)雞紅細(xì)胞吞噬試驗(yàn)免疫細(xì)胞功能測(cè)定T細(xì)胞增殖試驗(yàn)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：細(xì)胞毒試驗(yàn)3H四、重要免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹四、重要免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹抗體作為工具的治療和檢測(cè)方法細(xì)胞的分離和功能分子功能檢測(cè)

免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件（一）抗體作為工具的治療和檢測(cè)方法

抗體技術(shù)

ELISAWestern-blot

免疫沉淀免疫組織化學(xué)（一）抗體作為工具的治療和檢測(cè)方法抗體技術(shù)1.抗體技術(shù)抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段第一代：多克隆抗血清第二代：細(xì)胞工程抗體（單克隆抗體）第三代：基因工程抗體

1.抗體技術(shù)抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段（1）單克隆抗體技術(shù)原理

(1)B細(xì)胞能產(chǎn)生抗體，但不易在體外培養(yǎng)；

(2)骨髓瘤細(xì)胞能在體內(nèi)、外無(wú)限增殖，但不能分泌抗體；

(3)兩者形成的雜交瘤細(xì)胞即能大量增殖，又能合成和分泌特異性抗體。（1）單克隆抗體技術(shù)原理單克隆抗體的制備

制備單克隆抗體的方法是用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤細(xì)胞變異株與脾臟的B細(xì)胞融合。采用HAT選擇性培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中加次黃嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶核苷），變異的瘤細(xì)胞不具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺與尿核苷酸單磷酸合成DNA，這一途徑又被氨基喋呤所阻斷，所以未融合的瘤細(xì)胞不可避免也要死亡。

B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)基中不能長(zhǎng)期生長(zhǎng)，一般于二周內(nèi)均死亡。融合的雜交瘤細(xì)胞由于脾淋巴細(xì)胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶，可以通過(guò)次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，因此雜交瘤細(xì)胞大量繁殖而被篩選出來(lái)。單克隆抗體的制備免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件單克隆抗體與常規(guī)抗血清的性質(zhì)比較

單克隆抗體與常規(guī)抗血清的性質(zhì)比較（2）基因工程抗體類(lèi)型嵌合抗體人源化抗體完全人源化抗體抗體分子片段新型抗體分子V區(qū)C區(qū)CDRVHCH1CH2CH3VLCLC端L鏈H鏈N端（2）基因工程抗體類(lèi)型V區(qū)C區(qū)CDRVHCH1CH2CH3V嵌合抗體（chimericantibody）：在基因水平上將小鼠的Ig可變區(qū)與人的Ig恒定區(qū)嵌合在一起。

人源化抗體（humanizedantibody）：又稱(chēng)CDR移植抗體（CDRgraftingantibody）即將針對(duì)某種抗原的鼠源特異性抗體超變區(qū)代替人的Ig超變區(qū)，所產(chǎn)生的抗體幾乎為人源的。鼠抗體人-鼠嵌合抗體

人源化抗體嵌合抗體（chimericantibody）：在基因水平上完全人源化抗體完全人源化抗體是指將人類(lèi)抗體基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類(lèi)編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動(dòng)物中，使動(dòng)物表達(dá)人類(lèi)抗體，達(dá)到抗體全人源化的目的。方法：噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、基因工程小鼠制備法、轉(zhuǎn)染色體小鼠、抗體工程藥物標(biāo)聯(lián)及增效技術(shù)完全人源化抗體抗體分子片段：抗體分子的抗原結(jié)合部位局限在可變區(qū)組成的Fv段,保留抗體上的抗原特異性結(jié)合區(qū)域,構(gòu)建無(wú)Fc段、分子量較小、具抗原結(jié)合功能的分子片段的小分子抗體,其具有易于穿透血管壁和組織屏障進(jìn)入病灶,有利于腫瘤的診斷和治療,免疫原性強(qiáng),避免了Fc段與無(wú)關(guān)Fc受體結(jié)合所帶來(lái)的副作用,可作為載體分子偶聯(lián)多種活性蛋白基因如酶、毒素等用于疾病的導(dǎo)向性治療,且不需進(jìn)行糖基化修飾,可在大腸桿菌中表達(dá)等特點(diǎn)。從而可改善其抗體的藥代動(dòng)力學(xué)特性,并適合于臨床的應(yīng)用。

抗體分子片段：抗體分子的抗原結(jié)合部位局限在可變區(qū)組成的Fv①單鏈抗體（singlechainFv，scFv）

②二硫鍵穩(wěn)定的Fv(disulfide-stabilizedFv，ds-Fv)ds-FvscFvVHVLVLVHds-FvscFvVHVLVLVH③單域抗體（singledomainantibody）及分子識(shí)別單位（molecularrecognitionunit,MRU）即單個(gè)V區(qū)抗體。④多價(jià)抗體（multivalenantibody）和多特異抗體（mulit-specificantibody）是指含有多個(gè)共價(jià)結(jié)合的Fv，具有一種或多種特異性的基因工程抗體。

多價(jià)FvFv多特異Fv③單域抗體（singledomainantibody）及新型抗體分子將抗體分子的部分片段與抗體無(wú)關(guān)的序列相連接，或利用其可變區(qū)特異結(jié)合抗原特性的同時(shí)發(fā)揮其它的生物學(xué)活性；或利用Ig分子的恒定區(qū)某些功能特點(diǎn)來(lái)加強(qiáng)與其結(jié)合的功能分子生物活性。

Fc新型抗體分子Fc抗原化抗體（antigenantibody,AgAb）將具有編碼蛋白抗原表位的抗原基因片段植入抗體的超變區(qū)中，使肽鏈接近天然構(gòu)象，可模擬抗原分子使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體?？乖贵w（antigenantibody,AgAb）AphagemidvectorPhagemidvectorcontainingaleadersequence,afragmentofthegeneexpressingphagecoatprotein3andM13originofreplication.基因工程抗體的獲得常規(guī)的基因重組、表達(dá)技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)AphagemidvectorPhagemidvect免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件單克隆抗體的臨床應(yīng)用

所治療的疾病：腫瘤、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、器官移植、感染、心血管疾病等針對(duì)的抗原：細(xì)胞膜分子（CD分子、膜受體及粘附分子、腫瘤相關(guān)抗原）、細(xì)胞因子、獨(dú)特型、病毒單克隆抗體的臨床應(yīng)用免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件帕尼單抗（Panitumumab），即維克替比（Vectibix），安進(jìn)公司帕尼單抗（Panitumumab），免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件國(guó)內(nèi)已經(jīng)獲批生產(chǎn)的單抗產(chǎn)品公司名稱(chēng)商品名通用名適應(yīng)癥武漢生物制品研究所

注射用抗人T細(xì)胞CD3鼠單抗器官移植排異東莞宏逸士生物技術(shù)藥業(yè)

抗人白細(xì)胞介素/8單克隆抗體乳膏銀屑病恩博克大連亞維藥業(yè)

抗人白細(xì)胞介素/8單克隆抗體乳膏銀屑病上海中信國(guó)健藥業(yè)益賽普注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體/抗體融合蛋白類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等上海美恩生物技術(shù)唯美生碘[131I]腫瘤細(xì)胞核人鼠嵌合單克隆抗體注射液肝癌治療百泰生物藥業(yè)泰欣生尼妥珠單抗注射液結(jié)直腸癌上海賽金生物醫(yī)藥強(qiáng)克注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體/抗體融合蛋白強(qiáng)直性脊柱炎上海中信國(guó)健藥業(yè)健尼哌重組抗CD25人源化單克隆抗體注射液抗移植排斥國(guó)內(nèi)已經(jīng)獲批生產(chǎn)的單抗產(chǎn)品公司名稱(chēng)商品名通用名適應(yīng)癥武2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）將已知的抗原或抗體吸附于聚苯乙烯反應(yīng)板表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。通過(guò)級(jí)聯(lián)放大作用，酶催化底物顯色可進(jìn)行定性、定量分析微量的抗體或抗原。常用于標(biāo)記的酶為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）。靈敏度高，特異性好，操作簡(jiǎn)單，程序規(guī)范化。廣泛用于臨床疾病診斷。2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）將已知的抗原或抗體吸附于間接ELISA夾心ELISA競(jìng)爭(zhēng)ELISA左圖：酶標(biāo)板、移液器；右圖：酶標(biāo)儀間接ELISA左圖：酶標(biāo)板、移液器；右圖：酶標(biāo)儀間接ELISA：用于檢測(cè)液相中的抗體間接ELISA：用于檢測(cè)液相中的抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA：用來(lái)測(cè)定小分子抗原

夾心ELISA：測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原競(jìng)爭(zhēng)ELISA：用來(lái)測(cè)定小分子抗原

夾心ELISA：測(cè)定二價(jià)3.免疫印跡法（Western-blot）先將抗原經(jīng)SDS電泳分開(kāi)，再將分開(kāi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，然后放入含有抗體的液體中，洗去未結(jié)合抗體，再加標(biāo)記的二抗，通過(guò)顯色或發(fā)光顯示結(jié)果。3.免疫印跡法（Western-blot）先將抗原經(jīng)SDS免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件4.免疫沉淀法某些情況下，凝膠分離和印跡過(guò)程中抗原會(huì)降解，有些抗原表位會(huì)破壞，無(wú)法和特異抗體結(jié)合，此時(shí)，用免疫沉淀法可鑒定與抗體結(jié)合的抗原。該技術(shù)可用于可溶性抗原，也可用于細(xì)胞表面抗原的分析。待檢抗原用同位素標(biāo)記，加入抗體，使兩者特異結(jié)合，再加入共沉淀試劑，如proA等，使抗原抗體復(fù)合物沉淀下來(lái)，電泳后，固定膠經(jīng)放射自顯影，顯現(xiàn)特異標(biāo)記抗原所在的位置。4.免疫沉淀法某些情況下，凝膠分離和印跡過(guò)程中抗原會(huì)降解，免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件5.免疫組織化學(xué)用標(biāo)記的已知抗體與組織或細(xì)胞表面抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對(duì)抗原進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)的技術(shù)。常用方法：酶免疫組化（HRP等）免疫熒光技術(shù)（FITC、PE等）免疫金組化（膠體金）免疫電鏡技術(shù)（鐵蛋白、膠體金等）5.免疫組織化學(xué)用標(biāo)記的已知抗體與組織或細(xì)胞表面抗原發(fā)生反間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體（Hep2細(xì)胞）間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體（Hep2細(xì)胞）

免疫細(xì)胞的分離Ficoll的應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù)抗原特異性T細(xì)胞系的建立（二）細(xì)胞的分離和功能免疫細(xì)胞的分離（二）細(xì)胞的分離和功能

免疫細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞增殖的檢測(cè)：3H-TdR摻入法、CFSE效應(yīng)細(xì)胞測(cè)定：ELISPOT細(xì)胞毒試驗(yàn)Tetramer技術(shù)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：DNALadder、TUNEL、流式細(xì)胞技術(shù)（二）細(xì)胞的分離和功能免疫細(xì)胞功能測(cè)定（二）細(xì)胞的分離和功能1.淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）分離血細(xì)胞將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液（聚蔗糖-泛影葡胺）中即可配制成密度合適的分層液。不同動(dòng)物血中的單個(gè)核細(xì)胞對(duì)分離液的密度要求各不相同。水平式離心后，離心管中會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)不同層次的液體和細(xì)胞帶。BeforecentrifugeAftercentrifugemononuclearcells1.淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）分離血細(xì)胞將適量340g2.免疫磁珠分離技術(shù)將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)在磁性微珠上，與細(xì)胞懸液作用后置于磁場(chǎng)中，借磁力的作用將磁珠結(jié)合的細(xì)胞分開(kāi)。2.免疫磁珠分離技術(shù)將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)在磁性微免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件3.流式細(xì)胞技術(shù)3.流式細(xì)胞技術(shù)基本概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡(jiǎn)稱(chēng)FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性，并加以定量的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量基本概念原理原理流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)極短時(shí)間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，只要標(biāo)本中的細(xì)胞數(shù)量足夠，流式細(xì)胞儀（Flowcytometer）可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個(gè)細(xì)胞的速率進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量的細(xì)胞總數(shù)可達(dá)數(shù)千、數(shù)萬(wàn)乃至數(shù)百萬(wàn)個(gè)。可同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多種特征，當(dāng)同時(shí)用多種分子探針，如用不同熒光素標(biāo)記的不同單克隆抗體進(jìn)行多色熒光染色，通過(guò)流式細(xì)胞分析，即可獲得單細(xì)胞的多種信息，使細(xì)胞亞群的識(shí)別、計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。定性或定量分析細(xì)胞：通過(guò)熒光染色對(duì)單細(xì)胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達(dá)量、酶活性以及細(xì)胞的功能等均可進(jìn)行單細(xì)胞水平的定性與定量分析強(qiáng)大的分選功能，在分析的同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用1.淋巴細(xì)胞免疫分型

淋巴細(xì)胞亞群分析2.細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)3.免疫功能和免疫調(diào)控的研究淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化檢測(cè)細(xì)胞因子的檢測(cè)CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞CD4/CD8分析(HIV的診斷與研究)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用PE-CD19，F(xiàn)ITC-CD3抗體檢測(cè)淋巴細(xì)胞表型PE-CD19，F(xiàn)ITC-CD3抗體檢測(cè)淋巴細(xì)胞表型其他應(yīng)用：如細(xì)胞凋亡的分析、血液病、腫瘤及其基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)、干細(xì)胞研究等。其他應(yīng)用：4.T細(xì)胞系的建立4.T細(xì)胞系的建立5.細(xì)胞增殖的檢測(cè)：3H-TdR摻入法、CFSE觀察在有絲分裂原（PHA、ConA）或特異性抗原刺激下T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，測(cè)定細(xì)胞免疫功能。用3H-TdR法測(cè)T細(xì)胞增殖。5.細(xì)胞增殖的檢測(cè)：3H-TdR摻入法、CFSE觀察在有絲3H-TdR摻入法3H-TdR摻入法CFSE：羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-car-boxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFSE)是一種可穿過(guò)細(xì)胞膜的熒光染料,具有與細(xì)胞結(jié)合特異性的琥珀酰亞胺酯基團(tuán)與具有非酶促水解作用的羧基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)結(jié)合在一起可使CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。細(xì)胞經(jīng)CFSE染色后,在分裂增殖的過(guò)程中,標(biāo)記的CFSE可平均分配到子代細(xì)胞中,使熒光在細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中被逐漸稀釋,因而熒光強(qiáng)度逐漸減弱。即在1個(gè)增殖的細(xì)胞群中,各連續(xù)傳代細(xì)胞以熒光強(qiáng)度的1/2而遞減為特征。CFSE廣泛應(yīng)用于淋巴細(xì)胞的增殖試驗(yàn)中。此外,它還可應(yīng)用于細(xì)胞移植、細(xì)胞分裂周期的估算及細(xì)胞分選等方面。CFSE：羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-car-免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件6.效應(yīng)細(xì)胞測(cè)定：ELISPOT產(chǎn)生特異抗體的單個(gè)B細(xì)胞或分泌特異細(xì)胞因子的單個(gè)T細(xì)胞通過(guò)ELISPOT測(cè)定。測(cè)定抗體生成細(xì)胞，將淋巴細(xì)胞加入抗原致敏的板中。產(chǎn)生的特異性抗體即與抗體產(chǎn)生細(xì)胞鄰近的抗原發(fā)生結(jié)合。利用偶聯(lián)在抗免疫球蛋白上的酶和顯色劑，結(jié)合抗體的斑點(diǎn)即可被檢測(cè)。測(cè)定細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的板用抗細(xì)胞因子抗體包被，捕獲的細(xì)胞因子用酶標(biāo)記的抗細(xì)胞因子不同表位的抗體來(lái)測(cè)定。6.效應(yīng)細(xì)胞測(cè)定：ELISPOT產(chǎn)生特異抗體的單個(gè)B細(xì)胞或免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件7.細(xì)胞毒試驗(yàn)

CTL細(xì)胞通常測(cè)定它們裂解靶細(xì)胞的能力（如病毒感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等）。靶細(xì)胞裂解可由鉻釋放試驗(yàn)測(cè)定。靶細(xì)胞和51Cr一起孵育，51Cr被攝入靶細(xì)胞與蛋白結(jié)合。孵育后，把靶細(xì)胞轉(zhuǎn)至培養(yǎng)板與效應(yīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)4～16小時(shí)，取出上清，測(cè)量被效應(yīng)細(xì)胞裂解的靶細(xì)胞釋放的51Cr量。7.細(xì)胞毒試驗(yàn)

CTL細(xì)胞通常測(cè)定它們裂解靶細(xì)胞的能力（如鉻釋放細(xì)胞毒試驗(yàn)鉻釋放細(xì)胞毒試驗(yàn)8.Tetramer技術(shù)

Tetramer技術(shù)可以在離體細(xì)胞中測(cè)定抗原特異的CTL細(xì)胞，而無(wú)需體外擴(kuò)增。TCR識(shí)別的MHC-肽復(fù)合物直接染色抗原特異T細(xì)胞。TCR與MHC-肽復(fù)合物親和力低，迅速的解離無(wú)法進(jìn)行直接染色。帶有4個(gè)MHC-肽復(fù)合物的MHC四聚體可極大地增加對(duì)TCR的親和力。將適當(dāng)?shù)腗HC分子與一個(gè)肽段（BSP）融合，可作為生物素的底物，MHC-BSP和β2微球蛋白在E.coli中表達(dá)，與CTL的特異表位肽段混合，形成的MHC-肽段復(fù)合物被純化獲取。生物素化的復(fù)合物與熒光標(biāo)記的親和素以4:1比例混合產(chǎn)生四聚體。這些標(biāo)記的四聚體與抗原特異CTL結(jié)合，通過(guò)FACS檢測(cè)。8.Tetramer技術(shù)

Tetramer技術(shù)可以在離體細(xì)免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件9.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死是兩個(gè)不同的過(guò)程細(xì)胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學(xué)檢查L(zhǎng)adders實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢查與凋亡相關(guān)的病理過(guò)程HIV自身免疫性疾病腫瘤9.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死是兩個(gè)不同的過(guò)程細(xì)胞凋亡的生理意義在于：確保細(xì)胞正常發(fā)育和生長(zhǎng)；維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；細(xì)胞發(fā)揮積極的防御功能。細(xì)胞凋亡和許多疾病密切相關(guān)：細(xì)胞凋亡不足：如腫瘤和自身免疫??；細(xì)胞凋亡過(guò)度：如心肌缺血、心力衰竭、神經(jīng)元退行性疾病和病毒感染；凋亡不足與過(guò)度并存：如動(dòng)脈粥樣硬化。細(xì)胞凋亡的生理意義在于：細(xì)胞凋亡的主要表現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酶改變：Caspase-3活化細(xì)胞膜不對(duì)稱(chēng)性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI細(xì)胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實(shí)驗(yàn)凋亡相關(guān)蛋白：FasBcl-2細(xì)胞凋亡的主要表現(xiàn)(1)DNAladder凋亡細(xì)胞DNA可被核酸酶在核小體單位之間隨機(jī)切斷，產(chǎn)生180~200bp及其倍數(shù)的寡核苷酸片段，在瓊脂糖電泳中呈現(xiàn)階梯DNA區(qū)帶圖譜。(1)DNAladder凋亡細(xì)胞DNA可被核酸酶在核小體免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-biotinnickendlabeling)在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxyribonucleotidyl,TdT）和生物素標(biāo)記的核苷酸（dUTP），TdT能在游離的DNA3’端缺口連接標(biāo)記的核苷酸，利用生物素-親和素-酶（熒光）放大系統(tǒng)，在DNA斷裂處顯色，可標(biāo)示凋亡細(xì)胞。(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-b免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件(3)

流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡凋亡細(xì)胞因核斷裂，呈亞二倍體，用FACS分析亞二倍體數(shù)目，可指示細(xì)胞凋亡程度；因凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，膜磷脂成分暴露，可與熒光標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白（AnnexinV)結(jié)合，用FACS分析，可檢測(cè)懸浮細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的頻率。PI-Fluorescence#Events正常G0/G1期細(xì)胞(3)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)