生物化學(xué)過(guò)氧化氫酶Km值測(cè)定

過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饷资铣?shù)的意義，測(cè)定過(guò)氧化氫酶的米氏常數(shù)。學(xué)習(xí)一種測(cè)定酶Km值的方法熟悉和掌握過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定原理和方法二、相關(guān)知識(shí)與原理米氏方程與米氏常數(shù)（Km值）

米氏方程Km值:

酶促反應(yīng)速度為Vmax/2時(shí)的

底物濃度。單位是mol/LＶVmax[S]Km+[S]＝──相關(guān)知識(shí)Km值的含義Km值是酶的特征性常數(shù)之一Km值可近似表示酶對(duì)底物的親和力同一酶對(duì)于不同底物有不同的Km值測(cè)定Km是研究酶的一種重要方法，大多數(shù)酶的Km值在0.01∽100mmol/L之間。

雙倒數(shù)作圖法Vmax[S]Km+[S]V=兩邊同取倒數(shù)

（林－貝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]

繪制1/[S]與1/V的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其與X軸的交點(diǎn)即為－1/Km，以此求得該酶在測(cè)定條件下的Km值。Km值的測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)原理過(guò)氧化氫酶催化2H2O22H2O+O2↑反應(yīng)一定時(shí)間后，剩余過(guò)氧化氫進(jìn)行下述反應(yīng)2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O用KMnO4滴定可求出反應(yīng)前后H2O2的濃度差即反應(yīng)的速度。用不同的H2O2的起始量代表同一體系不同時(shí)刻的底物濃度。根據(jù)不同的底物濃度和對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從坐標(biāo)圖上讀出-1/Km，計(jì)算Km值。1、0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）。2、0.02mol/LKMnO4：稱(chēng)取KMnO43.2g，加蒸餾水1000mL，煮沸15min，2d后過(guò)濾，棕色瓶保存3、0.004mol/LKMnO4：稱(chēng)取恒重草酸鈉0.2g，加250mL冷沸水及10mL濃硫酸，用0.02mol/LKMnO4滴定至至微紅色，加熱至65℃，繼續(xù)滴定微紅色30s不褪，算出KMnO4的準(zhǔn)確濃度稀釋成0.004mol/L即可。三、試劑4、0.05mol/LH2O2:30%H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，用0.004mol/LKMnO4

標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度(標(biāo)定前稀釋4倍，取2mL，加25%H2SO42mL，用0.004mol/LKMnO4

滴定至微紅色)。(標(biāo)定0.05mol/LH2O2的實(shí)際濃度為0.053mol/L)5、25%H2SO4

5Na2C2O4+2KMnO4+8H2SO4=10CO2↑+2MnSO4+K2SO4+8H2O+5Na2SO4

1、酶液的制備：

每組(共分6組)稱(chēng)取馬鈴薯5g，加磷酸緩沖液10mL，研缽勻漿，濾紙過(guò)濾。四、實(shí)驗(yàn)步驟2、反應(yīng)速度的測(cè)定：取干燥的50-100ml錐形瓶6只，編號(hào)后按下表操作：試劑（mL）012345H2O2溶液/mL01.001.251.672.505.00蒸餾水/mL9.58.508.257.837.004.50酶液/mL0.500.500.500.500.500.50

先加好0.053mol/LH2O2和蒸餾水，加入酶液后立即混合搖勻并計(jì)錄時(shí)間，各瓶準(zhǔn)確靜置5分鐘后，立即加入25%H2SO42.0mL，邊加邊搖，以終止酶促反應(yīng)。最后用標(biāo)準(zhǔn)0.004mol/LKMnO4滴定剩余的H2O2至微紅色，記錄各瓶耗KMnO4的mL數(shù)。

3、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集（根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程填寫(xiě)下表）項(xiàng)目012345①加入H2O2的mL數(shù)②KMnO4的用量③加入H2O2的mmol數(shù)④剩余H2O2的mmol數(shù)＝②×0.004×2.5⑤反應(yīng)速度＝③－④⑥底物濃度[s]＝③÷10⑦1/v=1÷⑤÷5⑧1/[s]=1÷⑥注意事項(xiàng)反應(yīng)瓶中H2O2濃度計(jì)算：

〔S〕＝H2O2摩爾濃度×加入H2O2的mL數(shù)

10

＝加入H2O2的摩爾數(shù)

10

＝（mmol/mL）反應(yīng)速度的計(jì)算

V=加入的H2O2的毫摩爾數(shù)－剩余的H2O2的毫摩爾數(shù)/5min