糖的分析課件

糖的分析生命科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程羅云敬11/23/20221糖的分析生命科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程9/24/20221一、糖的概念（一）糖類的存在與來源糖是自然界分布很廣的一類化合物，幾乎所有的動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)都含有糖類。地球上糖類物質(zhì)的根本來源是綠色細(xì)胞進(jìn)行的光合作用。11/23/20222一、糖的概念（一）糖類的存在與來源9/24/20222糖類的主要生物學(xué)作用1．可作為生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，如纖維素。2．可轉(zhuǎn)變?yōu)樯匦璧钠渌镔|(zhì)，如脂類、蛋白質(zhì)等。3．是生物體主要的能量來源。4．可作為細(xì)胞識(shí)別的信息分子。11/23/20223糖類的主要生物學(xué)作用1．可作為生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，如纖維素。9（二）糖的化學(xué)本質(zhì)

糖也稱碳水化合物（carbohydrate），用Cm(H2O)n表示。碳水化合物這個(gè)名稱并不確切，但因沿用已久，所以至今在西文中還廣泛使用。糖是多羥醛或多羥酮及其縮聚物和某些衍生物的總稱。

多羥基醛多羥基酮11/23/20224（二）糖的化學(xué)本質(zhì)糖也稱碳水化合物（carbohydrat（三）糖結(jié)構(gòu)的測(cè)定寡糖與多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜：三個(gè)相同的氨基酸只能形成一種形式的三肽，而三個(gè)相同的己糖卻能構(gòu)成176種異構(gòu)體！測(cè)量的結(jié)構(gòu)包括：分子量糖鏈中糖殘基的種類和數(shù)量糖殘基結(jié)合的位置-連接點(diǎn)構(gòu)型11/23/20225（三）糖結(jié)構(gòu)的測(cè)定寡糖與多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜：三個(gè)相同的氨基酸只測(cè)定方法早期測(cè)定方法：顯色分析法滴定分析法基于比重的分析法現(xiàn)代分析法：自動(dòng)化液相色譜法流動(dòng)注射分析離子色譜毛細(xì)管電泳分離分析法核磁共振質(zhì)譜分析法……11/23/20226測(cè)定方法早期測(cè)定方法：現(xiàn)代分析法：9/24/202266.1糖的結(jié)構(gòu)單糖：寡糖：多糖是構(gòu)成各種糖分子的基本單位，按其分子中所含碳原子的數(shù)目，又分為丙、丁、戊、己和庚糖。由2～6個(gè)單糖縮合而成，二糖最為重要，如麥芽糖、蔗糖。由多個(gè)單糖分子縮合失水而成的高分子聚合物，分子量很大，如淀粉和纖維素等。結(jié)晶、溶于水、具有甜味不溶于水，無甜味11/23/202276.1糖的結(jié)構(gòu)單糖：是構(gòu)成各種糖分子的基本單位，按其分子中

單糖的命名：普遍以來源命名，如果糖、木糖、和葡萄糖。其中以五碳糖和六碳糖最為重要。D-葡萄糖11/23/20228單糖的命名：D-葡萄糖9/24/20228D-2-脫氧核糖b-D-2-脫氧核糖a-D-2-脫氧核糖a-D-(+)-葡萄糖a-D-(+)-甲基葡萄糖苷五碳糖（核糖）糖苷鍵11/23/20229D-2-脫氧核糖b-D-2-脫氧核糖a-D-2-脫氧核糖a-淀粉直鏈淀粉

分子量約1萬-200萬，250-260個(gè)葡萄糖分子，以（14）糖苷鍵聚合而成。呈螺旋結(jié)構(gòu)，遇碘顯紫藍(lán)色。支鏈淀粉中除了（14）糖苷鍵構(gòu)成糖鏈以外，在支點(diǎn)處存在（16）糖苷鍵，分子量較高。遇碘顯紫紅色。11/23/202210淀粉9/24/2022106.2糖的化學(xué)分析法一羰基的反應(yīng)是糖許多定性和定量分析方法的基礎(chǔ)還原法：糖類化合物的醛基和酮基在溶液中以游離和烯醇兩種形式存在，烯醇式糖類是具有一定活性的還原劑。最常見的還原反應(yīng)是將Cu2+還原為Cu+，在堿性溶液中形成黃色CuOH，在加熱的情況下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為不溶性Cu2O。11/23/2022116.2糖的化學(xué)分析法一羰基的反應(yīng)9/24/202211在嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件的情況下，Cu2O生成量的多少可以作為糖量多少的定量指標(biāo)。Cu2O的量可以通過其還原磷鉬酸到深藍(lán)色鉬藍(lán)進(jìn)行定量，其吸收波長(zhǎng)在700～750nm。烯醇式11/23/202212在嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件的情況下，Cu2O生成量的多少可以作為糖醛糖和酮糖與芳香胺的反應(yīng)醛糖和酮糖在冰乙酸中與不同的芳香胺發(fā)生縮合反應(yīng)生成有色物質(zhì)。常用的芳香胺有鄰茴香胺、對(duì)氨基水楊酸、對(duì)氨基苯甲酸、二苯胺和對(duì)氨基苯酚等。芳香胺類化合物對(duì)于某一種或者某一類的糖的反應(yīng)具有選擇性。但是芳香胺類化合物具有致癌性不適合于實(shí)驗(yàn)室使用。羰基的反應(yīng)11/23/202213醛糖和酮糖與芳香胺的反應(yīng)羰基的反應(yīng)9/24/202213與強(qiáng)酸和酚的反應(yīng)：戊糖和己糖與強(qiáng)酸和酚一起加熱，反應(yīng)時(shí)會(huì)分別產(chǎn)生呋喃或羥甲基呋喃衍生物，醛基然后與酚縮合產(chǎn)生有顏色的化合物11/23/202214與強(qiáng)酸和酚的反應(yīng)：9/24/202214糖糠醛或糠醛衍生物紫色濃HCL或H2SO4脫水α-萘酚11/23/202215糖糠醛或糠醛衍生物紫色濃己酮糖羥甲基糠醛紅色濃HCl,△

脫水間苯二酚11/23/202216己酮糖羥甲基糠醛紅色6.2.2多糖的結(jié)構(gòu)分析化學(xué)分析法：寡聚多糖與碘的反應(yīng)可以作為一些多糖定性分析的基礎(chǔ)碘與淀粉藍(lán)色碘與糖原和糊精紅色碘與纖維素?zé)o色11/23/2022176.2.2多糖的結(jié)構(gòu)分析化學(xué)分析法：9/24/202217過氧化反應(yīng)糖類被強(qiáng)氧化劑如高碘酸氧化時(shí)，碳鏈會(huì)發(fā)生斷裂pH5.0條件下加入高碘酸鈉于4℃進(jìn)行24小時(shí)，然后加入乙二醇破壞過量的高碘酸。通過所消耗的高碘酸的量可以推測(cè)多糖分子中所存在的相鄰羥基的數(shù)目。反應(yīng)中所消耗的高碘酸可以通過滴定或光譜法測(cè)定。11/23/202218過氧化反應(yīng)pH5.0條件下加入高碘酸鈉于4℃進(jìn)行24小時(shí)，然質(zhì)譜分析法：關(guān)鍵問題是離子化：快原子轟擊（FAB)、電噴霧離子化（ESI)和基體協(xié)助激光解吸離子化（MALDI)軟電離技術(shù)都適用于糖類分析。飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF-MS)和傅立葉變換質(zhì)譜（FT-MS)測(cè)大分子糖的分子量要比光散射法或凝膠滲透法精度高得多，特別是LC/MS和MS/MS分析法更有用。11/23/202219質(zhì)譜分析法：9/24/202219MALDI-TOF/MS用于測(cè)量寡糖的分子量，源后衰減技術(shù)（PostsourceDecay,PSD)用于測(cè)寡糖結(jié)構(gòu)。最有效的方法還是MALDI-FT-MS/MS法。11/23/202220MALDI-TOF/MS用于測(cè)量寡糖的分子量，源后衰減技術(shù)（步驟酶降解糖復(fù)合物，切割寡糖鏈；HPLC分離純化質(zhì)譜分析得出結(jié)論后，用其他方法核證，如GC/MS,MS/MS和NMR等11/23/202221步驟9/24/2022216.3糖的酶法分析當(dāng)化學(xué)分析法達(dá)不到分析特異性的要求，采用酶分析法通常可以在各種異構(gòu)體的混合物中實(shí)現(xiàn)對(duì)某一種的選擇性測(cè)定，并能區(qū)分α和β構(gòu)型常用的酶：β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶等11/23/2022226.3糖的酶法分析當(dāng)化學(xué)分析法達(dá)不到分析特異性的要求，采6.3.1基于葡萄糖氧化酶的葡萄糖分析β-D-葡萄糖+O2+H2OD-葡糖酸+H2O2α-D-葡萄糖被氧化的反應(yīng)速率低于β-D-葡萄糖的1%α-D-葡萄糖與β-D-葡萄糖兩種異構(gòu)體以平衡的形式存在，在變旋酶的作用下α向β不斷轉(zhuǎn)化，最終使得反應(yīng)進(jìn)行完全。11/23/2022236.3.1基于葡萄糖氧化酶的葡萄糖分析β-D-葡萄糖+O2基于顯色反應(yīng)的過氧化氫分析上述反應(yīng)所產(chǎn)生的過氧化氫可以用顯色法測(cè)定，最早用的底物為鄰-連甲苯胺和鄰-茴香胺，但是具有致癌性，已被取代。但是要注意避免過氧化物酶的干擾，它可以使過氧化氫變?yōu)樗脱鯕??；陔娀瘜W(xué)的過氧化氫分析是葡萄糖分析儀的基礎(chǔ)分析速度快，一分鐘之內(nèi)就可以完成，而且試劑及樣品的消耗少（10μl）。11/23/202224基于顯色反應(yīng)的過氧化氫分析9/24/2022246.3.2

基于葡萄糖脫氫酶或己糖激酶的葡萄糖分析法葡萄糖脫氫酶β-D-葡萄糖+NAD+/NADP+葡萄糖酸內(nèi)酯+NADH/NADPH利用動(dòng)力學(xué)法或固定時(shí)間法測(cè)定產(chǎn)物NADH在340nm處的吸收分析時(shí)要用變旋酶加速α型向β型D-葡萄糖的變化葡萄糖脫氫酶11/23/2022256.3.2基于葡萄糖脫氫酶或己糖激酶的葡萄糖分析法葡萄糖脫己糖激酶葡萄糖+ATP己糖激酶葡萄糖-6-磷酸+ADP葡萄糖-6-磷酸+NADP+G-6-P脫氫酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH++H+己糖激酶對(duì)于普通帖并不具有專一性，但是第二個(gè)反應(yīng)對(duì)葡萄糖-6-磷酸具有很高的專一性。11/23/202226己糖激酶葡萄糖+ATP己糖激酶葡萄糖-6-磷酸+ADP葡萄糖6.3.3其他己糖分析方法甘露糖-6-磷酸果糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸6-磷酸葡萄糖酸+NADPH甘露糖果糖葡萄糖己糖激酶+ATP己糖激酶+ATP己糖激酶+ATP利用己糖激酶分析甘露糖、果糖、及葡萄糖的原理，檢測(cè)在340nm處。11/23/2022276.3.3其他己糖分析方法甘露糖-6-磷酸甘露糖己糖激酶+6.4糖混合物的分離鑒定脎：黃色晶體，有固定熔點(diǎn)和固定晶形，成脎時(shí)間不同，可用來鑒別醛酮三種果糖具有相同的烯醇式，所以成脎的產(chǎn)物完全相同11/23/2022286.4糖混合物的分離鑒定脎：黃色晶體，有固定熔點(diǎn)和固定晶6.4.1紙色譜及薄層色譜糖的樣本一般溶于異丙醇中，質(zhì)量濃度大約為2g/L，點(diǎn)樣量一般為10μl定義葡萄糖的Rf值為100分離之后一般要經(jīng)過顯色反應(yīng)以確定糖的位置，使用不同的顯色劑有助于未知斑點(diǎn)的鑒定顯色是采用噴霧或浸入，在100℃下加熱5～10分鐘11/23/2022296.4.1紙色譜及薄層色譜糖的樣本一般溶于異丙醇中，質(zhì)量濃6.4.2氣相色譜法當(dāng)要鑒定或定量一種或多種糖類化合物，特別是量比較小時(shí)，用氣相或液相色譜法可以分離結(jié)構(gòu)十分相近的糖類化合物糖類需衍化為揮發(fā)性衍生物后方可用氣相色譜法，常見的衍生物類型有o-三甲基硅（TMS)。11/23/2022306.4.2氣相色譜法當(dāng)要鑒定或定量一種或多種糖類化合物，特

1·阿拉伯糖arabinose;2.半乳糖galactose;3.葡萄糖glucose;4.甘露糖mannose羊肚菌多糖的氣相色譜圖

可以看出,羊肚菌多糖MEP-SP2是由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖殘基為重復(fù)單元組成的,摩爾比為1.75∶4.13∶0.71∶0.6811/23/202231

1·阿拉伯糖arabinose;2.半乳糖galactos6.4.3高效液相色譜不需要衍生為氣化物質(zhì)用分配或者離子交換色譜分離，檢測(cè)使用紫外或折光率檢測(cè)器通常使用鍵合固定相，以反向色譜方式分離，洗脫用乙腈和水（80：20），其中含0.1mol/L的乙酸。11/23/2022326.4.3高效液相色譜不需要衍生為氣化物質(zhì)9/24/2026.4.4高效毛細(xì)管電泳法（HPCE)用化學(xué)衍生法為糖類帶上具有紫外吸收或發(fā)熒光的基團(tuán)：還原氨基化多數(shù)糖分子在通常情況下難以電離，通過衍生化其電離能力和疏水性也發(fā)生了相應(yīng)的變化