《土壤微生物生物量的測定-底物誘導呼吸法》編制說明

PAGE《土壤微生物生物量的測定-底物誘導呼吸法》編制說明（征求意見稿）《土壤微生物生物量的測定-底物誘導呼吸法》編制組二0一二年十二月一日目錄1、項目背景 12、標準制修定的必要性分析 12.1土壤微生物生物量的研究意義重大 12.2土壤質(zhì)量標準化與土壤科研工作的需要 23、土壤微生物生物量研究方法的歷史 34、標準編制的原則 45、標準制定的目標、主要技術內(nèi)容及說明 55.1方法研究的目標 55.2適用范圍 55.3術語和定義 55.4原理 65.5測量條件 65.6試劑與材料 65.7分析步驟 65.8結(jié)果計算 66、對實施本標準的建議 77、參考文獻 7PAGE8PAGE11、項目背景為了更好地監(jiān)測土壤的質(zhì)量和保護土壤環(huán)境，根據(jù)國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局國家標準化管理委員會文件國標委綜合【2011】82號《關于下達2011年第三批國家標準制修訂計劃的通知》，《土壤微生物生物量的測定-底物誘導呼吸法》順利立項。本標準由中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所和中國科學院南京土壤研究所共同承擔，計劃編號201111824-T-326。2012年5月，中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所接到轉(zhuǎn)化《Soilquality-Determinationofsoilmicrobialbiomass-Part1Substrateinducedrespirationmethod》（ISO142402-1:1997）的任務后，立即成立了標準編制組，小組成員包括多年從事土壤微生物分析研究和熟悉國家標準編制的專家。土壤微生物生物量是土壤有機質(zhì)最活躍和最易變化的部分，而且與土壤碳、氮、磷、硫等養(yǎng)分的循環(huán)密切相關，可直接或間接反映土壤肥力和土壤環(huán)境質(zhì)量的變化。目前土壤微生物生物量測定應用較為廣泛的方法有底物誘導呼吸法、熏蒸提取法等，但未制定國家標準。因此，土壤微生物生物量測定標準的編制，可以規(guī)范土壤微生物生物量的測定方法和擴大其應用范圍，有利于人們更好地了解土壤-微生物-植物-環(huán)境相互作用。2、標準制修定的必要性分析2.1土壤微生物生物量的研究意義重大土壤微生物生物量（soilmicrobialbiomass）是指生物體積小于5×103μm3活的微生物總量，但不包括活的植物體，如植物根系等(吳金水等，2006；李振高等，2008)。廣義的土壤微生物量應包括微生物碳、氮、磷、硫。眾所周知，土壤微生物是土壤有機質(zhì)和土壤養(yǎng)分(C,N,P,S等)轉(zhuǎn)化和循環(huán)的驅(qū)動力，它參與有機質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成、養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)的各個生化過程（林先貴，2010）。土壤微生物生物量雖然只占土壤有機質(zhì)的3%左右，但其作為土壤養(yǎng)分的儲存庫和植物生長可利用養(yǎng)分的重要來源，與微生物個體數(shù)量指標相比，更能反映微生物在土壤中的實際含量和作用潛力。據(jù)估計植物吸收N、P、S的60%，47%和28%分別來自微生物量N、P和S。而且，微生物是土壤中活的生命體，對土壤各種環(huán)境因子的變化極為敏感，因而微生物量的變化常被作為土壤肥力、土壤環(huán)境污染、其他各種擾動對土壤健康影響的靈敏性指標。因此，了解土壤微生物生物量有助于更好地理解影響土壤健康的主要因素，亦對制定良好措施來提高土壤質(zhì)量有重要意義。2.2土壤質(zhì)量標準化與土壤科研工作的需要土壤微生物量是植物有效養(yǎng)分的儲備庫和源，其對土壤碳、氮、磷和硫的植物有效性及在陸地生態(tài)系統(tǒng)的循環(huán)具有重要的影響。土壤微生物生物量庫的長期或是季節(jié)性變化都可作為土壤質(zhì)量的可靠的指示，對于了解土壤養(yǎng)分的動態(tài)變化具有重要的作用。土壤微生物生物量是一種可快速測定和重復性好的參數(shù)，也可以用于對土壤的粗略比較以及反映土壤管理的改變和污染的影響。土壤微生物生物量的定量分析是了解微生物對土壤有機質(zhì)與養(yǎng)分循環(huán)和轉(zhuǎn)化作用的重要方法。土壤微生物生物量的測定方法既有傳統(tǒng)方法，也有現(xiàn)代方法。在20世紀初發(fā)展起來的微生物計數(shù)方法至今仍在應用。同時隨著土壤生物學和生物化學的不斷發(fā)展，新的方法也層出不窮。在土壤微生物生物量測定方法中，底物誘導呼吸法是Anderson&Domsch（1978）首先提出的，根據(jù)添加的易分解底物在培養(yǎng)初期的分解速率來估計土壤微生物生物量。該方法操作簡單，耗費低，準確度較高，是土壤微生物生物量分析中的經(jīng)典方法。該方法已形成了國際標準，為了擴大土壤微生物生物量的測定方法的應用范圍，以及在土壤科學的科研工作中測定土壤微生物生物量指標時形成準確的、統(tǒng)一、可比較的數(shù)據(jù)，制定《土壤微生物生物量-底物誘導呼吸法》的國家標準十分必要。2.3國家及土壤質(zhì)量主管部門的要求目前，我國越來越重視標準化工作，國家標準制定的工作任務中要求形成我國自有知識產(chǎn)權的適合我國土壤質(zhì)量監(jiān)測與分析的相關標準。借此機遇，土壤科研領域的專家成立了“全國土壤質(zhì)量標準化技術委員會”，以期大力發(fā)展土壤質(zhì)量標準化工作，逐漸構(gòu)建我國土壤質(zhì)量標準化體系。根據(jù)國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局國家標準化管理委員會文件國標委綜合【2011】82號《關于下達2011年第三批國家標準制修訂計劃的通知》的要求，全國土壤質(zhì)量標準化委員會有15個土壤質(zhì)量國家標準通過國家標準委的審批并立項，“土壤微生物生物量-底物誘導呼吸法”即為其中的一個項目。根據(jù)國家標準制定工作的任務及土壤質(zhì)量國家標準制定的需要，完成該標準的制/修訂，對于指導我國土壤質(zhì)量監(jiān)測與監(jiān)管有重要意義。3、土壤微生物生物量研究方法的歷史早在20世紀70年代，土壤微生物學研究者采用土壤微生物細胞培養(yǎng)計數(shù)法，從土壤中提取和計數(shù)微生物的數(shù)量，但此種方法僅能獲得土壤中極少部分微生物，且不能得到有關這部分微生物活性方面的信息，遠不能滿足對土壤微生物特征的描述及研究其對土壤的重要作用。由于傳統(tǒng)的土壤微生物細胞培養(yǎng)計數(shù)法，提取和培養(yǎng)方法存在的不足，使得到的結(jié)果重復性較差，甚至相差3個數(shù)量級。盡管如此，培養(yǎng)計數(shù)法在很長時期內(nèi)仍然是微生物學家了解土壤微生物數(shù)量的基本方法。培養(yǎng)計數(shù)法的優(yōu)點是適合于對某些特殊土壤微生物的研究，但在使用該方法時應反復檢查其適應性。到1976年Jenkinson和Powlson提出間接法測定微生物生物量后，土壤微生物生物量庫在生態(tài)學和微生物學上才得到重視。該方法是基于氯仿熏蒸將土樣中微生物細胞殺死和溶解，再用土壤接種，測定培養(yǎng)10天內(nèi)土樣的呼吸，與未熏蒸對照土樣比較，由于熏蒸土樣微生物被殺死和微生物生物碳的分解，從而使釋放的CO2增加。該方法稱為熏蒸－培養(yǎng)法（FI）。與此同時還提出采用FI法測定土壤微生物生物量氮。Anderson等在1978年提出了測定微生物生物量的另一生理學方法，即所謂的底物誘導呼吸法（Substrate-inducedrespiration，SIR）。該方法主要基于微生物在純培養(yǎng)時對易利用底物（如葡萄糖）供應在呼吸作用上有直接的響應，由此推斷易利用底物引起的呼吸量變化與土壤微生物生物量碳呈線性關系。FI和SIR法都有其不足之處。FI法需較長時間（10天），且不適合酸性土壤。SIR法是采用FI法校準，不同的校正系數(shù)使采用SIR測定的數(shù)據(jù)計算得到的微生物生物量碳常常會產(chǎn)生爭議，此外SIR法不適合添加了新鮮有機底物的土壤。Anderson和Domsch于1975年提出采用選擇性抑制技術分別測定土壤細菌和真菌生物量，通過添加特異性抗生素能抑制土壤中的細菌或真菌的生長，從而可測定計算得到真菌與細菌的比率。West等1987年提出了通過測定土壤麥角甾醇含量估計土壤真菌生物量，因為麥角甾醇是大多數(shù)子囊菌、擔子菌和半知菌類中主要的甾醇，可作為真菌生物量的指示。但目前還發(fā)現(xiàn)沒有一個通用的轉(zhuǎn)換系數(shù)將麥角甾醇含量轉(zhuǎn)換為真菌生物量，該方法測定真菌生物量引起科研人員的質(zhì)疑，指出麥角甾醇含量只能反映土壤真菌細胞膜量。盡管如此，麥角甾醇含量仍然能在一定程度上估算土壤中真菌群落生物量。至今仍用于土壤真菌生物量的測定。1976年，Jenkinson和Powlson等最先提出了土壤微生生物量碳的熏蒸培養(yǎng)法，為土壤微生物生物量的測定找到一種較為方便的間接方法。但該方法對熏蒸滅菌、熏蒸后去除氯仿及培養(yǎng)裝置的密封性、培養(yǎng)條件和時間需要嚴格的要求，而且培養(yǎng)時間較長，不適宜樣品的大量分析。Brookes等在1982和1985年分別提出了更直接的估算土壤微生物生物量磷和氮的方法。經(jīng)氯仿熏蒸的土樣直接提?。囱簦崛》?，F(xiàn)umigation-extration，F(xiàn)E）后測定土壤微生物生物量磷和氮。1981年Sagger等采用FE法測定土壤微生物生物量硫。1987年Vance等在FE法的基礎上，建立了氯仿熏蒸提取-容量分析法測定土壤微生物生物量碳。之后，Wu等（1990,1993）對FE法測定土壤微生物生物量的方法進行了改進，又建立了氯仿熏蒸提取-儀器分析法，該方法更為快速、簡便、精確，適于大量樣品的分析。SIR和FE法已成為測定土壤微生物生物量最常用的2種方法，目前這2種方法已被一些國家（如德國）權威機構(gòu)認定為土壤常規(guī)監(jiān)測方法，形成了國際標準（ISO142402-1:1997:E和ISO142402-2:1997:E）。國內(nèi)在土壤科學研究中，根據(jù)其目的的不同也多采用SIR和FE法對土壤微生物生物量進行測定分析，但還尚未形成國家標準。4、標準編制的原則（1）本標準的編寫依據(jù)《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫》和《標準化工作指南第2部分：采用國際標準》（2）本標準的制定與國際標準《Soilquality-determinationofsoilmicrobialbiomass-Part1substrateinducedrespirationmethod》（ISO142402-1:1997:E）的一致性為等同的原則（3）本標準方法準確可靠，能滿足土壤科學研究與土壤質(zhì)量監(jiān)測分析測試的要求（4）本標準方法具有普遍適用性，操作簡單，耗費低，易于推廣應用。5、標準制定的目標、主要技術內(nèi)容及說明本標準的主要內(nèi)容包括：術語和定義、原理、測量條件、試劑與材料、儀器、程序、及結(jié)果計算等。5.1方法研究的目標（1）確定方法的適用范圍（2）轉(zhuǎn)化ISO142402-1:1997方法，形成標準文本（3）通過實驗和驗證，確定方法的可行性和適用性5.2適用范圍等同轉(zhuǎn)化ISO142402-1:1997標準規(guī)定土壤微生物生物量-底物誘導呼吸法的測定方法。等同轉(zhuǎn)化ISO142402-1:1997標準適用于通氣良好的農(nóng)業(yè)土壤及礦質(zhì)土壤中好氣型異養(yǎng)微生物生物量的測定，但不可用于土壤化學物質(zhì)對生物量影響的測定。5.3術語和定義土壤微生物生物量土壤中所有微生物細胞的生物量。這一指標可通過計算這些細胞中碳或氮的含量來測定，或者通過它們礦化外加碳源的能力計算。在用碳或氮含量分析時可能包括死細胞或者細胞碎片，但用呼吸法時，測量的是活細胞生物量。土壤呼吸速率一定溫度條件下，單位時間單位質(zhì)量土壤釋放出的CO2量。5.4原理本標準通過向土壤加入葡萄糖，形成系列葡萄糖含量梯度，直到達到最高呼吸速率（一般不超過1小時）。這一呼吸速率作為最大初始呼吸速率，可用于估算土壤活性生物量。5.5測量條件本標準生物量的測定需要在恒溫（22±1℃）恒濕環(huán)境中進行。土壤樣品含水量要求與原狀土一致。需要注意的是，土壤呼吸速率到生物量的轉(zhuǎn)化系數(shù)，其計算的溫度條件是22±15.6試劑與材料土壤樣品土壤采樣，處理及貯存參考ISO10381-6進行。土壤樣品的分析等效轉(zhuǎn)化ISO142402-1:1997的方法。材料粉末狀D-葡萄糖，細石英（顆粒直徑為0.1-0.5mm）或者滑石粉。儀器除常用實驗室儀器設備，還需要以下儀器：陶瓷研缽、攪拌機、全自動紅外氣體分析儀或氣相色譜。5.7分析步驟等同采用ISO142402-1:1997中的分析步驟5.8結(jié)果計算本標準中土壤微生物生物量碳（X）的測定采用以下公式:X=40R+0.37其中X是土壤微生物生物量碳，單位mgkg-1R是CO2的釋放速率，單位mlh-1式中40為轉(zhuǎn)換系數(shù)，由熏蒸-培養(yǎng)法測定的土壤呼吸速率與土壤微生物生物量關系得出。6、對實施本標準的建議《土壤微生物生物量測定-底物誘導呼吸法》標準操作簡單，耗費低，適用范圍廣，能夠適用我國土壤肥力監(jiān)測的要求。但土壤誘導呼吸量受土壤濕度影響很大，為了減少因土壤濕度對分析的影響，建議用葡萄糖水溶液代替葡萄糖粉劑，同時改變換算系數(shù)。7、參考文獻AndersonJ.P.E.&DomschK.H.(1975)Measurementofbacterialandfungalcontributiontorespirationofselectedagriculturalandforestsoils.Can.J.Microbiol.21:314–332.BrookesP.C.etal.(1982)Measurementofmicrobialbiomassphosphorusinsoil.SoilBiol.Biochem.14:319–329BrookesP.C.etal.(1985)Chloroformfumigationandthereleaseofsoilnitrogen:arapiddirectextractionmethodtomeasuremicrobialbiomassnitrogeninsoil.SoilBiol.Biochem.17:837–842ISO142402-1:1997(E).Soilquality-Determinationofsoilmicrobialbiomass-Part1SubstrateinducedrespirationmethodJenkinsonD.S.&PowlsonD.S.(1976)Theeffectsofbiocidaltreatmentsonmetabolisminsoil—Ⅰ.Fumigationwithchloroform.SoilBiol.Biochem.8:167–177JenkinsonD.S.&PowlsonD.S.(1976)Theeffectsofbiocidaltreatmentonmetabolisminsoil—Ⅴ.Amethodformeasuringsoilbiomass.SoilBiol.Biochem.8:209–213SaggerS.etal.(1981)Measurementsoilofmicrobialsulfurinsoil.SoilBiol.Biochem.13:493–498SaggerS.etal.(1981)Sulphurtransformationsinrelationtocarbonandnitrogeninincubatedsoil.SoilBio