蔡奕彪創(chuàng)新答辯-中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院課件

固體發(fā)酵培養(yǎng)南海紅樹林內(nèi)生真菌1403#次級代謝產(chǎn)物研究答辯人：蔡奕彪導(dǎo)師：蔡小玲講師中山大學(xué)創(chuàng)新論文答辯固體發(fā)酵培養(yǎng)南海紅樹林內(nèi)生真菌1403#次級代謝產(chǎn)物研究答辯1蔡奕彪2009年6月5日

原創(chuàng)性聲明

本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。蔡奕彪2主要內(nèi)容一、研究意義二、實驗方法及創(chuàng)新之處三、結(jié)果與討論四、總結(jié)主要內(nèi)容一、研究意義3開發(fā)新藥陸地海洋海洋生物紅樹林內(nèi)生真菌開發(fā)新藥陸地海洋海洋生物紅樹41、海洋紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、種類繁多，是天然藥物先導(dǎo)化合物的重要來源。

2、近年來，從海洋真菌中分離鑒定了許多結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物，這些化合物顯示了良好的抗腫瘤、抗細(xì)菌或抗真菌等生物活性，為新藥的開發(fā)和各種疑難疾病的治愈提供了新的希望。

一、研究意義1、海洋紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、種類繁多，是53、在固體發(fā)酵中，菌體可以更高效地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生

。4、固體發(fā)酵還有含水量少，廢水、廢渣少，環(huán)境污染少等優(yōu)點。

3、在固體發(fā)酵中，菌體可以更高效地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，61、實驗方法（固體培養(yǎng)）第一步：菌種和菌種的固體培養(yǎng)。

采用了固體營養(yǎng)基，對1403#內(nèi)生真菌進(jìn)行固體發(fā)酵，使用PDA固體培養(yǎng)基（10g蛋白胨、5g酵母膏、10gNaCl、1.5%的瓊脂，加dH2O溶解后，調(diào)pH至7.4，ｄH2O定容至1L，115℃，20min高壓滅菌），接種于平板上的固體培養(yǎng)基中，在溫度設(shè)置在26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天。2、創(chuàng)新之處：二、實驗方法及創(chuàng)新之處1、實驗方法（固體培養(yǎng)）二、實驗方法及創(chuàng)新之處7第二步：提取和分離

。

近4升的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)30天后，將固體培養(yǎng)基切碎，并用甲醇（MO）浸泡一周后，用紗布過濾，分離固體培養(yǎng)基和菌液，此過程重復(fù)3次，培養(yǎng)基曬干，菌液濃縮，再用乙酸乙酯（EA）萃取，EA提取物用適量的200-300目硅膠拌樣，上柱粗分。分別用5%，10%，20%，30%，50%，80%，100%的EA\PE（石油醚）淋洗，收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析，重結(jié)晶純化。固體培養(yǎng)基曬干后，用MO反復(fù)浸泡。提取物濃縮后合并，再拌硅膠過大柱，以EA\PE梯度淋洗。收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析，重結(jié)晶純化。

第二步：提取和分離。82、本實驗創(chuàng)新之處-----固體培養(yǎng)A、固體發(fā)酵中，菌體可以更高效地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生

B、固體發(fā)酵含水量少，廢水、廢渣少，環(huán)境污染少等優(yōu)點。2、本實驗創(chuàng)新之處-----固體培養(yǎng)9C、固體發(fā)酵更好的模擬了其生活環(huán)境，且當(dāng)菌株附著與固體基質(zhì)上生長時，供氧豐富，生長密度大，生存競爭更為激烈，因此產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物的量也會提高

蔡奕彪創(chuàng)新答辯-中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院課件101、此次固體培養(yǎng)1403#內(nèi)生真菌，經(jīng)過分離純化得到5個化合物，尚未得到新化合物，目前分離仍在進(jìn)行中，下面是所分離得到的化合物。

A、灰黃霉素B、去氯灰黃霉素

三、結(jié)果與討論1、此次固體培養(yǎng)1403#內(nèi)生真菌，經(jīng)過分離純化得到5個化合11C、1,4-二羥基-7-甲基-9,10-蒽醌

D、大黃酚

C、1,4-二羥基-7-甲基-9,10-蒽醌12E、化合物1-hydroxy-3-methylanthracene-9,10-dione(3-8)蔡奕彪創(chuàng)新答辯-中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院課件132、討論

由于海洋環(huán)境具有低溫、高壓、高鹽、少光照、貧營養(yǎng)等特點，所以海洋微生物有著自己獨特的代謝方式，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的代謝產(chǎn)物。本文是對對南海紅樹林內(nèi)生真菌1403#進(jìn)行了固體培養(yǎng)，得到一系列的醌類類化合物。由于只培養(yǎng)量較少（4升），相對于液體培養(yǎng)，產(chǎn)量還是較豐富，但尚未得到新化合物，目前分離仍在進(jìn)行中。2、討論14總結(jié)1.初步介紹了來自中國南海紅樹林內(nèi)生真菌1403#的次級代謝產(chǎn)物。2.采用固體培養(yǎng)這種比較新穎的方法發(fā)現(xiàn)了五種化合物。3.固體發(fā)酵對產(chǎn)量有極大的影響，下一步的工作還有就是更換種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基，對真菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對固液發(fā)酵的影響因素進(jìn)行探討，以得到更豐富的代謝產(chǎn)物。

總結(jié)1.初步介紹了來自中國南海紅樹林內(nèi)生真菌1403#的次級15謝謝!謝謝!16固體發(fā)酵培養(yǎng)南海紅樹林內(nèi)生真菌1403#次級代謝產(chǎn)物研究答辯人：蔡奕彪導(dǎo)師：蔡小玲講師中山大學(xué)創(chuàng)新論文答辯固體發(fā)酵培養(yǎng)南海紅樹林內(nèi)生真菌1403#次級代謝產(chǎn)物研究答辯17蔡奕彪2009年6月5日

原創(chuàng)性聲明

本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。蔡奕彪18主要內(nèi)容一、研究意義二、實驗方法及創(chuàng)新之處三、結(jié)果與討論四、總結(jié)主要內(nèi)容一、研究意義19開發(fā)新藥陸地海洋海洋生物紅樹林內(nèi)生真菌開發(fā)新藥陸地海洋海洋生物紅樹201、海洋紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、種類繁多，是天然藥物先導(dǎo)化合物的重要來源。

2、近年來，從海洋真菌中分離鑒定了許多結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物，這些化合物顯示了良好的抗腫瘤、抗細(xì)菌或抗真菌等生物活性，為新藥的開發(fā)和各種疑難疾病的治愈提供了新的希望。

一、研究意義1、海洋紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、種類繁多，是213、在固體發(fā)酵中，菌體可以更高效地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生

。4、固體發(fā)酵還有含水量少，廢水、廢渣少，環(huán)境污染少等優(yōu)點。

3、在固體發(fā)酵中，菌體可以更高效地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，221、實驗方法（固體培養(yǎng)）第一步：菌種和菌種的固體培養(yǎng)。

采用了固體營養(yǎng)基，對1403#內(nèi)生真菌進(jìn)行固體發(fā)酵，使用PDA固體培養(yǎng)基（10g蛋白胨、5g酵母膏、10gNaCl、1.5%的瓊脂，加dH2O溶解后，調(diào)pH至7.4，ｄH2O定容至1L，115℃，20min高壓滅菌），接種于平板上的固體培養(yǎng)基中，在溫度設(shè)置在26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天。2、創(chuàng)新之處：二、實驗方法及創(chuàng)新之處1、實驗方法（固體培養(yǎng)）二、實驗方法及創(chuàng)新之處23第二步：提取和分離

。

近4升的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)30天后，將固體培養(yǎng)基切碎，并用甲醇（MO）浸泡一周后，用紗布過濾，分離固體培養(yǎng)基和菌液，此過程重復(fù)3次，培養(yǎng)基曬干，菌液濃縮，再用乙酸乙酯（EA）萃取，EA提取物用適量的200-300目硅膠拌樣，上柱粗分。分別用5%，10%，20%，30%，50%，80%，100%的EA\PE（石油醚）淋洗，收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析，重結(jié)晶純化。固體培養(yǎng)基曬干后，用MO反復(fù)浸泡。提取物濃縮后合并，再拌硅膠過大柱，以EA\PE梯度淋洗。收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析，重結(jié)晶純化。

第二步：提取和分離。242、本實驗創(chuàng)新之處-----固體培養(yǎng)A、固體發(fā)酵中，菌體可以更高效地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生

B、固體發(fā)酵含水量少，廢水、廢渣少，環(huán)境污染少等優(yōu)點。2、本實驗創(chuàng)新之處-----固體培養(yǎng)25C、固體發(fā)酵更好的模擬了其生活環(huán)境，且當(dāng)菌株附著與固體基質(zhì)上生長時，供氧豐富，生長密度大，生存競爭更為激烈，因此產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物的量也會提高

蔡奕彪創(chuàng)新答辯-中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院課件261、此次固體培養(yǎng)1403#內(nèi)生真菌，經(jīng)過分離純化得到5個化合物，尚未得到新化合物，目前分離仍在進(jìn)行中，下面是所分離得到的化合物。

A、灰黃霉素B、去氯灰黃霉素

三、結(jié)果與討論1、此次固體培養(yǎng)1403#內(nèi)生真菌，經(jīng)過分離純化得到5個化合27C、1,4-二羥基-7-甲基-9,10-蒽醌

D、大黃酚

C、1,4-二羥基-7-甲基-9,10-蒽醌28E、化合物1-hydroxy-3-methylanthracene-9,10-dione(3-8)蔡奕彪創(chuàng)新答辯-中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院課件292、討論

由于海洋環(huán)境具有低溫、高壓、高鹽、少光照、貧營養(yǎng)等特點，所以海洋微生物有著自己獨特的代謝方式，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的代謝產(chǎn)物。本文是對對南海紅樹林內(nèi)生真菌1403#進(jìn)行了固體培養(yǎng)，得到一系列的醌類類化合物。由于只培養(yǎng)量較少（4升），相對于液體培養(yǎng)，產(chǎn)量還是較豐富，但尚未得到新化合物，目前分離