研究亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR課件

季明華唐金海亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與乳腺癌新輔助化療敏感性關系的研究探討季明華唐金海亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與乳腺癌新輔助乳腺癌（breastcancer)是女性最常見的惡性腫瘤，近年來乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)著上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計目前全世界每年死于乳腺癌的病例約為41萬人，約占女性全部癌癥死亡病例的14%，居女性癌癥死因的首位或第二位。乳腺癌（breastcancer)是女性最常見◆研究目的和意義■目的：研究亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T、A1298C多態(tài)與乳腺癌患者對新輔助化療敏感性的關系。

■意義：尋找可靠的預測指標指導個體化治療,從而為進一步實現(xiàn)乳腺癌規(guī)范化綜合治療提供參考依據(jù)?！粞芯磕康暮鸵饬x■目的：研究亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHF◆研究對象2008年1月至2009年4月在江蘇省腫瘤醫(yī)院就診的61例乳腺癌患者新輔助化療惡性證據(jù)可測量病灶術后病理◆研究對象2008年1月至2009年4月新輔助化療惡性證據(jù)◆評定標準▲

化療療效的評定標準：參照WHO實體瘤療效評定標準分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、無變化(SD)和進展(PD)。以CR和PR為有效◆評定標準▲化療療效的評定標準：以CR和PR為有效▲化療后病理反應分級標準

0級：癌細胞沒有變化；I級：癌細胞有輕度變化或有顯著變化但＜2/3的范圍II級癌細胞顯著變化達2/3或以上III級癌細胞完全消失或壞死，被肉芽組織和(或)纖維組織替代

把I～III級定為病理有反應！

▲化療后病理反應分級標準◆實驗技術路線★白細胞層DNA提取步驟●

MTHFRC677T

多態(tài)性檢測方法●結果判斷●

HinfI酶切MTHFR677基因DNA片段產物電泳圖▲

MTHFRA1298C多態(tài)性檢測方法▲結果判斷▲

MboⅡ酶切MTHFRA1298C基因DNA片段產物電泳圖◆實驗技術路線★白細胞層DNA提取步驟§試劑:4×dNTPs（寶生物工程(大連)有限公司))引物（寶生物工程(大連)有限公司)Taq酶(北京博瑞科技有限公司)限制性內切酶HinfI(寶生物工程(大連)有限公司)10×Buffer(寶生物工程(大連)有限公司)§儀器:PCR擴增儀兩臺(美國MJ公司，德國Biometra公司)冷凍高速離心機(0～16000r/min)(德國Eppendorf公司)可調式移液器(0～2μl,0～100μl,0～1000μl)(GILSON公司)●

MTHFRC677T基因多態(tài)性檢測方法§試劑:●MTHFRC677T基因多態(tài)性檢測方法PCR擴增MTHFR677基因片段

(198bp)

MTHFR677基因型檢測（HinfI酶切PCR擴增產物）

結果判斷PCR擴增MTHFR677基因片段●結果判斷1）當為677C/C基因型時，PCR產物不能被限制性內切酶HinfI

酶所識別，PCR產物則不能被消化，瓊脂糖凝膠上表現(xiàn)為198bp片段，可清晰見到198bp一條亮帶。2）當為677T/T基因型時，PCR產物被限制性內切酶HinfI酶消化后可產生175bp、23bp二個新的片段。其中23bp的片段由于太短而無法在凝膠上清楚的顯示，故瓊脂糖凝膠上只可清晰的見到175bp一條亮帶。3）當為677C/T基因型時，可產生198bp、175bp、和23bp三個片段。其中23bp的片段由于太短而在凝膠上無法清楚顯示，故瓊脂糖凝膠上只清晰見到198bp和175bp兩條亮帶?！窠Y果判斷1）當為677C/C基因型時，PCR產物不能●

HinfI酶切MTHFR677基因DNA

片段產物電泳圖lane1:Maker;lane2:C/Cgenotype;lane3:C/Tgenotype;lane4:T/Tgenotype.198bp175bp●HinfI酶切MTHFR677基因DNA

§試劑:4×dNTPs（寶生物工程(大連)有限公司))引物（寶生物工程(大連)有限公司)Taq酶(北京博瑞科技有限公司)限制性內切酶MboⅡ（寶生物工程(大連)有限公司)10×Buffer(寶生物工程(大連)有限公司)§儀器:PCR擴增儀兩臺(美國MJ公司，德國Biometra公司)冷凍高速離心機(0～16000r/min)(德國Eppendorf公司)可調式移液器(0～2μl,0～100μl,0～1000μl)(GILSON公司)▲MTHFRA1298C基因多態(tài)性檢測方法§試劑:▲MTHFRA1298C基因多態(tài)性檢測方法PCR擴增MTHFRA1298C基因片段

(84bp)

MTHFRA1298C基因型檢測（MboⅡ酶切PCR擴增產物）

結果判斷PCR擴增MTHFRA1298C基因片段▲結果判斷1）當為1298A/A基因型時，PCR產物被限制性內切酶MboⅡ消化后可產生56bp、28bp二個新的片段。其中28bp的片段由于太短而在凝膠上無法清楚顯示，故瓊脂糖凝膠上只可清晰見到56bp一條亮帶。2）當為1298A/C基因型時，可產生84bp、56bp、和28bp三個片段。其中28bp的片段由于太短而在凝膠上無法清楚顯示，故瓊脂糖凝膠上只可清晰見到84bp和56bp兩條亮帶?！Y果判斷1）當為1298A/A基因型時，PCR產物被限▲

MboⅡ酶切MTHFRA1298C基因

DNA片段產物電泳圖lane1:Maker;lane2:ProductofPCR；lane3:A/Agenotype;lane4:A/Cgenotype.56bp84bp▲MboⅡ酶切MTHFRA1298C基因

D●MTHFR基因型和新輔助化療療效的關系(表1）GenetypeC677TA1298CtypeT/TC/TC/CA/AA/CC/Cffectsofchemotherapy

X2P

CR+PR(%)SD+PD(%)15(83.3)3(16.7)21(72.4)8(27.6)6(42.9)8(57.1)31(70.5)13(29.5)11(64.7)6(35.3)00

0.720.405.540.020.190.67●MTHFR基因型和新輔助化療療效的關系(表1）Effec●MTHFR基因型與乳腺癌新輔助化療病理反應率

的關系（表2）GenetypeC677TA1298CtypeT/TC/TC/CA/AA/CC/C/p>

reactionrateofchemotherapy

X2P

0(%)Ⅰ－Ⅲ(%)3(16.7)15(83.3)10(34.5)19(65.5)9(64.3)5(35.7)13(29.5)31(70.5)9(52.9)8(47.1)00

1.720.197.380.012.860.09●MTHFR基因型與乳腺癌新輔助化療病理反應率

的關一.MTHFR基因多態(tài)性與化療敏感性之間有何關系？

5,10-MTHF

5－MTHFMTHFR同型半光氨酸蛋氨酸s-腺苷蛋氨酸蛋氨酸合成酶甲基供體

DNA的低甲基化DNA修復能力降低化療敏感性的變化

DNA的甲基化

MTHFRgenovariation一.MTHFR基因多態(tài)性與化療敏感性之間有何關系？5,10二.本研究的結果得出的結論？MTHFR677T／T患者的化療療效MTHFR677T／TI～III級化療反應率MTHFR677C／C患者的化療療效MTHFR677C／CI～III級化療反應率MTHFR677C／T患者的化療療效MTHFR677C／TI～III級化療反應率

50.0<P50.0<PP<0.05P<0.05insignificantdifferences

significantdifferences

MTHFRC677T基因多態(tài)與乳腺癌新輔助化療敏感性之間存在著一定的相關性二.本研究的結果得出的結論？MTHFR677T／TMTHMTHFR1298A/C患者的化療療效MTHFR1298A/A患者的化療療效MTHFR1298A/CI～III級化療反應率MTHFR1298A/AI～III級化療反應率50.0<P50.0<PinsignificantdifferencesMTHFRA1298C基因多態(tài)與乳腺癌新輔助化療敏感性之間相關性不明顯有文獻報道1298基因多態(tài)對細胞內葉酸分布的影響明顯低于677基因多態(tài),故1298基因多態(tài)對化療敏感性的影響同樣低于677基因多態(tài)，本研究結果亦然。

[VanderPutNM,GabreelsF,StevensEM,etal.AsecondcommonMutationinthemethylenetetrahydrololatereductasegene:anadditionalriskfactorforneural-tubedefects[J].AmJHumGenet,2005,62(2):1044-1051.

]MTHFR1298A/AMTHFR1298A/A50.0季明華唐金海亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與乳腺癌新輔助化療敏感性關系的研究探討季明華唐金海亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與乳腺癌新輔助乳腺癌（breastcancer)是女性最常見的惡性腫瘤，近年來乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)著上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計目前全世界每年死于乳腺癌的病例約為41萬人，約占女性全部癌癥死亡病例的14%，居女性癌癥死因的首位或第二位。乳腺癌（breastcancer)是女性最常見◆研究目的和意義■目的：研究亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T、A1298C多態(tài)與乳腺癌患者對新輔助化療敏感性的關系。

■意義：尋找可靠的預測指標指導個體化治療,從而為進一步實現(xiàn)乳腺癌規(guī)范化綜合治療提供參考依據(jù)。◆研究目的和意義■目的：研究亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHF◆研究對象2008年1月至2009年4月在江蘇省腫瘤醫(yī)院就診的61例乳腺癌患者新輔助化療惡性證據(jù)可測量病灶術后病理◆研究對象2008年1月至2009年4月新輔助化療惡性證據(jù)◆評定標準▲

化療療效的評定標準：參照WHO實體瘤療效評定標準分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、無變化(SD)和進展(PD)。以CR和PR為有效◆評定標準▲化療療效的評定標準：以CR和PR為有效▲化療后病理反應分級標準

0級：癌細胞沒有變化；I級：癌細胞有輕度變化或有顯著變化但＜2/3的范圍II級癌細胞顯著變化達2/3或以上III級癌細胞完全消失或壞死，被肉芽組織和(或)纖維組織替代

把I～III級定為病理有反應！

▲化療后病理反應分級標準◆實驗技術路線★白細胞層DNA提取步驟●

MTHFRC677T

多態(tài)性檢測方法●結果判斷●

HinfI酶切MTHFR677基因DNA片段產物電泳圖▲

MTHFRA1298C多態(tài)性檢測方法▲結果判斷▲

MboⅡ酶切MTHFRA1298C基因DNA片段產物電泳圖◆實驗技術路線★白細胞層DNA提取步驟§試劑:4×dNTPs（寶生物工程(大連)有限公司))引物（寶生物工程(大連)有限公司)Taq酶(北京博瑞科技有限公司)限制性內切酶HinfI(寶生物工程(大連)有限公司)10×Buffer(寶生物工程(大連)有限公司)§儀器:PCR擴增儀兩臺(美國MJ公司，德國Biometra公司)冷凍高速離心機(0～16000r/min)(德國Eppendorf公司)可調式移液器(0～2μl,0～100μl,0～1000μl)(GILSON公司)●

MTHFRC677T基因多態(tài)性檢測方法§試劑:●MTHFRC677T基因多態(tài)性檢測方法PCR擴增MTHFR677基因片段

(198bp)

MTHFR677基因型檢測（HinfI酶切PCR擴增產物）

結果判斷PCR擴增MTHFR677基因片段●結果判斷1）當為677C/C基因型時，PCR產物不能被限制性內切酶HinfI

酶所識別，PCR產物則不能被消化，瓊脂糖凝膠上表現(xiàn)為198bp片段，可清晰見到198bp一條亮帶。2）當為677T/T基因型時，PCR產物被限制性內切酶HinfI酶消化后可產生175bp、23bp二個新的片段。其中23bp的片段由于太短而無法在凝膠上清楚的顯示，故瓊脂糖凝膠上只可清晰的見到175bp一條亮帶。3）當為677C/T基因型時，可產生198bp、175bp、和23bp三個片段。其中23bp的片段由于太短而在凝膠上無法清楚顯示，故瓊脂糖凝膠上只清晰見到198bp和175bp兩條亮帶。●結果判斷1）當為677C/C基因型時，PCR產物不能●

HinfI酶切MTHFR677基因DNA

片段產物電泳圖lane1:Maker;lane2:C/Cgenotype;lane3:C/Tgenotype;lane4:T/Tgenotype.198bp175bp●HinfI酶切MTHFR677基因DNA

§試劑:4×dNTPs（寶生物工程(大連)有限公司))引物（寶生物工程(大連)有限公司)Taq酶(北京博瑞科技有限公司)限制性內切酶MboⅡ（寶生物工程(大連)有限公司)10×Buffer(寶生物工程(大連)有限公司)§儀器:PCR擴增儀兩臺(美國MJ公司，德國Biometra公司)冷凍高速離心機(0～16000r/min)(德國Eppendorf公司)可調式移液器(0～2μl,0～100μl,0～1000μl)(GILSON公司)▲MTHFRA1298C基因多態(tài)性檢測方法§試劑:▲MTHFRA1298C基因多態(tài)性檢測方法PCR擴增MTHFRA1298C基因片段

(84bp)

MTHFRA1298C基因型檢測（MboⅡ酶切PCR擴增產物）

結果判斷PCR擴增MTHFRA1298C基因片段▲結果判斷1）當為1298A/A基因型時，PCR產物被限制性內切酶MboⅡ消化后可產生56bp、28bp二個新的片段。其中28bp的片段由于太短而在凝膠上無法清楚顯示，故瓊脂糖凝膠上只可清晰見到56bp一條亮帶。2）當為1298A/C基因型時，可產生84bp、56bp、和28bp三個片段。其中28bp的片段由于太短而在凝膠上無法清楚顯示，故瓊脂糖凝膠上只可清晰見到84bp和56bp兩條亮帶。▲結果判斷1）當為1298A/A基因型時，PCR產物被限▲

MboⅡ酶切MTHFRA1298C基因

DNA片段產物電泳圖lane1:Maker;lane2:ProductofPCR；lane3:A/Agenotype;lane4:A/Cgenotype.56bp84bp▲MboⅡ酶切MTHFRA1298C基因

D●MTHFR基因型和新輔助化療療效的關系(表1）GenetypeC677TA1298CtypeT/TC/TC/CA/AA/CC/Cffectsofchemotherapy

X2P

CR+PR(%)SD+PD(%)15(83.3)3(16.7)21(72.4)8(27.6)6(42.9)8(57.1)31(70.5)13(29.5)11(64.7)6(35.3)00

0.720.405.540.020.190.67●MTHFR基因型和新輔助化療療效的關系(表1）Effec●MTHFR基因型與乳腺癌新輔助化療病理反應率

的關系（表2）GenetypeC677TA1298CtypeT/TC/TC/CA/AA/CC/C/p>

reactionrateofchemotherapy

X2P

0(%)Ⅰ－Ⅲ(%)3(16.7)15(83.3)10(34.5)19(65.5)9(64.3)5(35.7)13(29.5)31(70.5)9(52.9)8(47.1)00

1.720.197.380.012.860.09●MTHFR基因型與乳腺癌新輔助化療病理反應率

的關一.MTHFR基因多態(tài)性與化療