分子醫(yī)學(xué)技能實(shí)驗(yàn)課件：本科實(shí)驗(yàn)一-基因組DNA的提取與純化

分子醫(yī)學(xué)技能中山醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室銀巍Email：yinwei@分子醫(yī)學(xué)技能中山醫(yī)學(xué)院銀巍

關(guān)于分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)課程嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室管理是必須的關(guān)于課堂設(shè)計(jì)和教學(xué)注意事項(xiàng)課程要求及考核關(guān)于實(shí)驗(yàn)教學(xué)關(guān)于實(shí)驗(yàn)教學(xué)

基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、Southern雜交（包括RFLP）及PCR分離基因等。

一、基因組DNA的提取與純化

基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文一、基因組核酸分離純化的總原則：

保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完整排除其他分子的污染（蛋白質(zhì)、脂類、糖、有機(jī)熔劑、金屬離子、外源DNA、

RNA等）

核酸分離純化的總原則：核酸提取的主要步驟

主要包括：破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及多糖、脂類等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子、去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等。核酸提取的主要步驟核酸提取注意事項(xiàng)減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解（如過(guò)量酸堿）減少物理因素對(duì)核酸的降解（機(jī)械剪切力：強(qiáng)烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融；高溫等）防止核酸的生物降解（核酸酶的預(yù)防）

核酸提取注意事項(xiàng)二、人基因組DNA的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x

1.從人口腔上皮細(xì)胞中提取純的基因組DNA2.掌握基因組DNA抽提的方法，理解核酸分離純化的基本原理二、人基因組DNA的制備

基因組DNA提取原理

利用基因組DNA較長(zhǎng)的特性，可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)漂浮其中，可用玻璃棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達(dá)到提取的目的?；蚪MDNA提取原理利用基因組DNA較長(zhǎng)的特性，可以

分離純化基因組DNA的方法有很多種：不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同，分離方法也有差異。但原理相似，都是利用兩種DNA的差異來(lái)分離的，因此它們有共同的步驟：

①裂解細(xì)胞：SDS裂解細(xì)胞，EDTA抑制核酸酶②除去蛋白質(zhì)：蛋白酶K水解蛋白質(zhì)，酚和氯仿/異戊醇抽提、分離蛋白質(zhì)；③析出DNA：乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。分離純化基因組DNA的方法有很多種：

實(shí)驗(yàn)材料及試劑

材料：人口腔上皮細(xì)胞試劑：抽提緩沖液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAaseSDS，蛋白酶K，飽和酚氯仿/異戊醇（24:1）

75%及95%乙醇

TE緩沖液：Tris，EDTA實(shí)驗(yàn)材料及試劑主要試劑的功能

抽提緩沖液：由SDS、EDTA、蛋白酶K組成.SDS的作用是裂解細(xì)胞.EDTA的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子,防止DNA

酶對(duì)DNA分子的降解作用。蛋白酶K的作用是水解蛋白質(zhì)。酚和氯仿/異戊醇：抽提分離蛋白質(zhì)乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA主要試劑的功能取材:用生理鹽水漱口后，口含生理鹽水10~15ml約2~3min，用15ml離心管（4000rpm

10min）收集細(xì)胞沉淀

①

（臺(tái)式離心機(jī)的使用，平衡）

加入0.5ml抽提緩沖液，重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管

（微量移液器的正確使用）混勻，65℃溫育15min

加入等體積的飽和酚(0.5ml)，充分顛倒混勻（不要震蕩?。㏄13實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)（一人一組）：

取材:用生理鹽水漱口后，口含生理鹽水10~15ml約2~3m12000rpm5min②，400ul上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管

（高速離心機(jī)的使用與安全意識(shí)）

加入400ul等體積氯仿/異戊醇，顛倒混勻12000rpm5min，400ul上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管

加入2倍體積800ul95%的乙醇，顛倒混勻12000rpm5min

③

12000rpm5min②，400ul上層水相轉(zhuǎn)移至新的E分子醫(yī)學(xué)技能實(shí)驗(yàn)課件：本科實(shí)驗(yàn)一-基因組DNA的提取與純化棄上清，沉淀中加入1ml75%乙醇

12000rpm2min

④

輕輕棄去上清，打開(kāi)EP蓋，室溫靜置5~10min

加入30l0.1×TE溶液，42℃助溶10min后4℃保存

棄上清，沉淀中加入1ml75%乙醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其分析

定性分析：DNA瓊脂糖凝膠電泳定量分析：紫外分光光度法測(cè)定DNA溶液的濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其分析常見(jiàn)問(wèn)題：

1、提取的DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵過(guò)程反應(yīng)時(shí)間過(guò)短；離心時(shí)間或速度不夠。

2、提取的DNA成涂布狀：操作過(guò)程中用力過(guò)猛，動(dòng)作粗暴；操作系統(tǒng)有污染。

3、與細(xì)胞器DNA分離不全；變性過(guò)程不完全；試劑配置問(wèn)題。常見(jiàn)問(wèn)題：微量加樣槍使用程序及注意事項(xiàng)

分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室微量加樣槍使用程序及注意事項(xiàng)分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分子醫(yī)學(xué)技能實(shí)驗(yàn)課件：本科實(shí)驗(yàn)一-基因組DNA的提取與純化第一步:看整體操作按鈕容量刻度套頭第一步:看整體操作按鈕容量刻度套頭操作按鈕容量刻度套頭操作按鈕容量刻度套頭第二步:看大小調(diào)節(jié)加樣槍容量時(shí)切勿超過(guò)最大容量，否則加樣槍將被損壞。第二步:看大小調(diào)節(jié)加樣槍容量時(shí)切勿超過(guò)最大容量，否則加20l1000l100l10010020020l1000l100l100100200調(diào)節(jié)加樣槍容量時(shí)切勿超過(guò)最大容量，否則加樣槍將被損壞

0.5--10l20--200l100--1000l10.02001000調(diào)節(jié)加樣槍容量時(shí)切勿超過(guò)最大容量，否則加樣槍將被損壞0.5第三步:學(xué)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)鈕切記:

看著刻度調(diào)大小刻度第三步:學(xué)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)鈕切記:刻度第四步:學(xué)使用一擋吸取二擋放切記:第四步:學(xué)使用一擋吸取二擋放切記:第五步:學(xué)維護(hù)1調(diào)節(jié)加樣槍容量時(shí)切勿超過(guò)最大容量，否則加樣槍將被損壞。2切勿自行拆卸加樣槍

3對(duì)腐蝕性及毒性試劑等注意防范。第五步:學(xué)維護(hù)1調(diào)節(jié)加樣槍容量時(shí)切勿超過(guò)最大容量，否則1每次實(shí)驗(yàn)課前主管技術(shù)員檢查確認(rèn)加樣槍完好后交帶教老師簽名領(lǐng)取。2帶教老師檢查確認(rèn)加樣槍完好后按編號(hào)交各組學(xué)生使用。3學(xué)生使用完后按編號(hào)交回帶教老師。4帶教老師確認(rèn)加樣槍完好后交主管技術(shù)員檢查簽收。

微量加樣槍使用程序

1每次實(shí)驗(yàn)課前主管技術(shù)員檢查確認(rèn)加樣槍完好后交帶教老師簽名分子醫(yī)學(xué)技能中山醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室銀巍Email：yinwei@分子醫(yī)學(xué)技能中山醫(yī)學(xué)院銀巍

關(guān)于分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)課程嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室管理是必須的關(guān)于課堂設(shè)計(jì)和教學(xué)注意事項(xiàng)課程要求及考核關(guān)于實(shí)驗(yàn)教學(xué)關(guān)于實(shí)驗(yàn)教學(xué)

基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、Southern雜交（包括RFLP）及PCR分離基因等。

一、基因組DNA的提取與純化

基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文一、基因組核酸分離純化的總原則：

保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完整排除其他分子的污染（蛋白質(zhì)、脂類、糖、有機(jī)熔劑、金屬離子、外源DNA、

RNA等）

核酸分離純化的總原則：核酸提取的主要步驟

主要包括：破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及多糖、脂類等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子、去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等。核酸提取的主要步驟核酸提取注意事項(xiàng)減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解（如過(guò)量酸堿）減少物理因素對(duì)核酸的降解（機(jī)械剪切力：強(qiáng)烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融；高溫等）防止核酸的生物降解（核酸酶的預(yù)防）

核酸提取注意事項(xiàng)二、人基因組DNA的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x

1.從人口腔上皮細(xì)胞中提取純的基因組DNA2.掌握基因組DNA抽提的方法，理解核酸分離純化的基本原理二、人基因組DNA的制備

基因組DNA提取原理

利用基因組DNA較長(zhǎng)的特性，可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)漂浮其中，可用玻璃棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達(dá)到提取的目的?；蚪MDNA提取原理利用基因組DNA較長(zhǎng)的特性，可以

分離純化基因組DNA的方法有很多種：不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同，分離方法也有差異。但原理相似，都是利用兩種DNA的差異來(lái)分離的，因此它們有共同的步驟：

①裂解細(xì)胞：SDS裂解細(xì)胞，EDTA抑制核酸酶②除去蛋白質(zhì)：蛋白酶K水解蛋白質(zhì)，酚和氯仿/異戊醇抽提、分離蛋白質(zhì)；③析出DNA：乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。分離純化基因組DNA的方法有很多種：

實(shí)驗(yàn)材料及試劑

材料：人口腔上皮細(xì)胞試劑：抽提緩沖液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAaseSDS，蛋白酶K，飽和酚氯仿/異戊醇（24:1）

75%及95%乙醇

TE緩沖液：Tris，EDTA實(shí)驗(yàn)材料及試劑主要試劑的功能

抽提緩沖液：由SDS、EDTA、蛋白酶K組成.SDS的作用是裂解細(xì)胞.EDTA的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子,防止DNA

酶對(duì)DNA分子的降解作用。蛋白酶K的作用是水解蛋白質(zhì)。酚和氯仿/異戊醇：抽提分離蛋白質(zhì)乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA主要試劑的功能取材:用生理鹽水漱口后，口含生理鹽水10~15ml約2~3min，用15ml離心管（4000rpm

10min）收集細(xì)胞沉淀

①

（臺(tái)式離心機(jī)的使用，平衡）

加入0.5ml抽提緩沖液，重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管

（微量移液器的正確使用）混勻，65℃溫育15min

加入等體積的飽和酚(0.5ml)，充分顛倒混勻（不要震蕩！）P13實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)（一人一組）：

取材:用生理鹽水漱口后，口含生理鹽水10~15ml約2~3m12000rpm5min②，400ul上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管

（高速離心機(jī)的使用與安全意識(shí)）

加入400ul等體積氯仿/異戊醇，顛倒混勻12000rpm5min，400ul上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管

加入2倍體積800ul95%的乙醇，顛倒混勻12000rpm5min

③

12000rpm5min②，400ul上層水相轉(zhuǎn)移至新的E分子醫(yī)學(xué)技能實(shí)驗(yàn)課件：本科實(shí)驗(yàn)一-基因組DNA的提取與純化棄上清，沉淀中加入1ml75%乙醇

12000rpm2min

④

輕輕棄去上清，打開(kāi)EP蓋，室溫靜置5~10min

加入30l0.1×TE溶液，42℃助溶10min后4℃保存

棄上清，沉淀中加入1ml75%乙醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其分析

定性分析：DNA瓊脂糖凝膠電泳定量分析：紫外分光光度法測(cè)定DNA溶液的濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其分析常見(jiàn)問(wèn)題：

1、提取的DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵過(guò)程反應(yīng)時(shí)間過(guò)短；離心時(shí)間或速度不夠。

2、提取的DNA成涂布狀：操作過(guò)程中用力過(guò)猛，動(dòng)作粗暴；操作系統(tǒng)有污染。

3、與細(xì)胞器DNA分離不全；變性過(guò)程不完全；試劑配置問(wèn)題。常見(jiàn)問(wèn)題：微量加樣槍使用程序及注意事項(xiàng)

分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室微量加樣槍使用程序及注意事項(xiàng)分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分子醫(yī)學(xué)技能實(shí)驗(yàn)課件：本科實(shí)驗(yàn)一-基因組DN