生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三講-分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)課件

第三講分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

分子生態(tài)學(xué)是上世紀(jì)90年代初新興的一門生態(tài)學(xué)分支學(xué)科，應(yīng)用分子生物學(xué)的原理和方法來研究生命系統(tǒng)與環(huán)境系統(tǒng)相互作用的生態(tài)機(jī)理及其分子機(jī)制的科學(xué)，闡明自然種群和引進(jìn)種群與環(huán)境之間的聯(lián)系，評(píng)價(jià)重組生物體釋放對(duì)環(huán)境的影響（Smith,1993)。

分子生態(tài)學(xué)主要研究?jī)?nèi)容：物種起源與進(jìn)化、轉(zhuǎn)基因生物的生態(tài)學(xué)效應(yīng)評(píng)估、瀕危物種的保護(hù)、有害動(dòng)物的控制、醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用等。第三講分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

分子生態(tài)分子生態(tài)學(xué)的研究方法

主要包括兩大類：基于DNA層次的研究方法和基于蛋白質(zhì)層次的研究方法。

DNA層次的主要研究對(duì)象是線粒體DNA、葉綠體DNA、核糖體DNA、基因組DNA；蛋白質(zhì)層次的研究多采用多位點(diǎn)等位酶技術(shù)。分子生態(tài)學(xué)的研究方法主要包括兩大類：分子標(biāo)記的種類與歷史蛋白質(zhì)：同工酶(等位酶)：六十年代以來核苷酸序列和片段：tRNA（1965）1980年以來：RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)）1984年以來：SSR(短重復(fù)序列標(biāo)記)1990年以來：RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài))1993年以來：AFLP(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài))分子標(biāo)記的種類與歷史蛋白質(zhì)：同工酶(等位酶)：六十年代以來一等位酶技術(shù)酶是基因編碼的產(chǎn)物，在電場(chǎng)中遷移率的改變可反映酶蛋白的大小、構(gòu)形和肽鏈氨基酸的序列變化，即編碼DNA順序上的變化，通過分析酶譜的變化可獲得所需的遺傳信息。在酶譜分析中，等位酶是常用的分析工具。等位酶是同一基因位點(diǎn)的不同等位基因所編碼的同一種酶的不同形式，等位酶作為基因表達(dá)的產(chǎn)物間接反映酶基因位點(diǎn)及等位基因的變化，是衡量遺傳變異的重要遺傳標(biāo)記。一等位酶技術(shù)

在種內(nèi)水平上，

等位酶可作為一種穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記。根據(jù)等位酶譜帶的遺傳分析確定出每種等位基因在居群中的頻率，從而計(jì)算出它們的遺傳相似度或遺傳距離，對(duì)種群的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)做出估計(jì)，測(cè)量種群的遺傳多樣性以及各種群間的遺傳距離。等位酶技術(shù)主要應(yīng)用于居群的遺傳結(jié)構(gòu)及其時(shí)空變化、居群分化和物種形成、種間關(guān)系、遺傳育種、生物多樣性、推斷雜種或多倍體的親本、類群間的親緣性等領(lǐng)域。在種內(nèi)水平上，等位酶可作為一種穩(wěn)定的遺傳標(biāo)等位酶技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：操作相對(duì)簡(jiǎn)單，花費(fèi)少，統(tǒng)計(jì)方法標(biāo)準(zhǔn)，并且有大量的前人資料可以借鑒。缺點(diǎn)：但對(duì)一些狹域分布的地方種群，往往缺乏多態(tài)性的位點(diǎn)，無法進(jìn)行等位酶分析（至少需分析10-20個(gè)獨(dú)立分離的多態(tài)性位點(diǎn)，才能達(dá)到統(tǒng)計(jì)的可信度)。另外分析時(shí)一定要保持酶的活性。等位酶技術(shù)材料的采集研磨和酶的提取酶的保存凝膠制備電泳凝膠切片酶的組織化學(xué)染色酶譜的記錄與分析數(shù)據(jù)分析等位酶分析的過程材料的采集研磨和酶的提取酶的保存凝膠制備電泳凝膠切片酶的組織1材料采集和提取液的選擇

植物體任何有活性的部位都可用來進(jìn)行等位酶分析，因幼嫩組織酶活性最高，故一般采集幼嫩葉片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行等位酶分析首先要把有功能的可溶性酶蛋白質(zhì)從植物細(xì)胞中提取出來，并保證這些酶的活性。常用提取液：簡(jiǎn)單磷酸提取緩沖液和復(fù)雜磷酸提取緩沖液。多數(shù)栽培植物和花粉可用簡(jiǎn)單緩沖液提取，而大多數(shù)野生植物由于含有較多酚類等有害于酶蛋白質(zhì)的物質(zhì)，一般用復(fù)雜提取緩沖液。其中，Tris-HCl提取緩沖液最常用。1材料采集和提取液的選擇

當(dāng)研磨植物樣品材料時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，許多影響酶活性的干擾物質(zhì)，如酚類、萜類、果膠、樹脂、香豆素和一些色素等釋放出來，與酶相互作用，導(dǎo)致酶失活。因此在提取液中必須添加提取緩沖液(簡(jiǎn)稱提取液)，防止酶在提取過程中被破壞。

其中，酚類物質(zhì)的影響最大。酚類易被氧化成醌類，與蛋白質(zhì)的硫氫基(-SH)反應(yīng)，發(fā)生褐變，此為提取樣品時(shí)酶失活的一個(gè)標(biāo)志。添加的保護(hù)物質(zhì)多用來消除酚類物質(zhì)對(duì)酶的破壞作用，一般用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如PVP、二硫蘇糖醇、抗壞血酸鈉(Vc鈉鹽)和β-巰基乙醇等，或抑制酚氧化酶活性的物質(zhì)，如偏重亞硫酸鈉和四硼酸鈉等，可抑制或逆轉(zhuǎn)酚氧化成醌。另外，二乙基二硫代氨基甲酸可通過作用于含銅活性中心抑制酚氧化酶。當(dāng)研磨植物樣品材料時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，許多影響酶活性注意：并不是各種添加劑對(duì)酶都是有益的。如：二乙基二硫代氨基甲酸影響SOD的銅-鋅輔酶，偏重亞硫酸鈉抑制某些脫氫酶系統(tǒng)，

PVP可能抑制谷氨酰胺合成酶(GS)。因此，確定合適的保護(hù)物質(zhì)時(shí)，最好先進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)。如果材料寶貴又缺乏經(jīng)驗(yàn)，使用復(fù)雜提取液比較保險(xiǎn)。但如果材料所含干擾物質(zhì)少，應(yīng)盡量選用簡(jiǎn)單提取液，防止提取液抑制酶的活性。注意：并不是各種添加劑對(duì)酶都是有益的。如：復(fù)雜提取緩沖液以Tris-HCl

提取緩沖液最常用

，配方如下：

0.01g乙二胺四乙酸四鈉鹽(EDTANa4)

0.019g氯化鉀(KCl)0.05g氯化鎂(MgCl2·6H2O)1~5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1.25g蔗糖25.00mLTris-HCl緩沖液(0.1mol/L,pH7.5)把PVP放入溶液攪拌溶解，或者水合過夜。放入冰箱保存。使用前按1-2%（v/v）加入2-巰基乙醇。復(fù)雜提取緩沖液以Tris-HCl提取緩沖液最常用，配方如2酶系統(tǒng)的選擇

酶系統(tǒng)的選擇：

對(duì)酶譜作正確的分析，必須了解該酶蛋白分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)于酶分子結(jié)構(gòu)清楚的電泳圖譜，一般可以結(jié)合染色體的倍性水平可靠地判定位點(diǎn)和等位基因。許多種酶分子的亞基數(shù)目已基本上清楚，而且在不同的類群中保持恒定。在選擇酶系統(tǒng)時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮植物系統(tǒng)學(xué)研究常選用的酶系統(tǒng)，這些酶的結(jié)構(gòu)基本清楚。有些酶(如ACP、EST、PER等)的結(jié)構(gòu)尚不清楚。這些酶系統(tǒng)的位點(diǎn)數(shù)目很多，酶譜相當(dāng)復(fù)雜，酶譜的解釋如無可靠的遺傳分析為基礎(chǔ)，會(huì)產(chǎn)生多種可能的解釋，其結(jié)果往往不可靠。2酶系統(tǒng)的選擇生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三講-分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)課件3電泳膠的制備酶電泳的介質(zhì)有多種，最常用：淀粉凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。

與聚丙烯酰胺比較，淀粉無毒，且顯色效果和聚丙烯酰胺膠顯色效果差不多。

1）制備淀粉膠淀粉膠通常用煮沸水解淀粉和相應(yīng)的緩沖液的混合物配制。電泳緩沖系統(tǒng)包括兩種緩沖溶液：膠緩沖液:用于膠的制備；電極緩沖液:在電泳遷移的時(shí)候用來連接電極和膠。3電泳膠的制備制膠程序：1、在三角燒瓶里放入48g水解淀粉和400ml膠緩沖液，用保鮮膜蓋住瓶口。用微波爐加熱混合物，每間隔10～20秒搖一下，以防結(jié)塊。膠粘稠之后，再繼續(xù)煮會(huì)變得透明、均一。連續(xù)煮開兩次。2、接上真空泵抽氣約20秒。待膠稍冷后，將膠倒在調(diào)好水平的玻璃板上的框子里。約30分鐘后膠冷卻，即成淀粉膠。制好的膠若當(dāng)時(shí)不用，最好用塑料保鮮膜將它覆蓋起來，以防止水分蒸發(fā)后膠干裂。否則，蛋白在電泳遷移過程中會(huì)產(chǎn)生變形。制膠程序：生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三講-分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)課件4緩沖液系統(tǒng)的選擇

緩沖液系統(tǒng)的選擇是等位酶電泳分析中的重要一環(huán)。因?yàn)椴煌拿傅鞍椎姆肿咏Y(jié)構(gòu)和電荷不同，使用不同的緩沖液分離效果也不一樣。目前，用于淀粉凝膠電泳的緩沖液系統(tǒng)很多，常用以下幾種：TC(Tris-Citrate)緩沖液、TBE(Tris-Borate-EDTA)緩沖液、TBE(Tris-Borate-Na２EDTA)緩沖液、Borate-NaOH緩沖液4緩沖液系統(tǒng)的選擇Ⅰ.TC(Tris-Citrate)緩沖液：

pH值7.0，適用于LDH，MDH，ME，IDH，EsD，6PGD，ACO，ADA，HBDH，HK，ACP，AK，CK，PER，GOT，PGM，ALD，CEs，GPI，SUDH，SOD等酶。電泳條件：恒流35～40mA，3～4小時(shí)。電極緩沖液：Tris（三羥甲基氨基甲烷）16.35g+Citricacid（檸檬酸）9.04g加蒸餾水至1000ml，用Tris或檸檬酸調(diào)pH值至7.0膠緩沖液：稀釋66.7ml電極緩沖液至1000mlⅠ.TC(Tris-Citrate)緩沖液：Ⅱ．TBE(Tris-Borate-EDTA)緩沖液，pH值8.6,適用于CAR，CAT，Dia，F(xiàn)K，GDA，GLO等酶。電泳條件：恒流60mA，5小時(shí)貯存液：0.9mol／dm3Tris109g0.5mol／dm3Boricacid（硼酸）30g0.02mol／dm3EDTA（乙二胺四乙酸）7.6g加蒸餾水至1000ml電極緩沖液：pH值8.61:4稀釋貯存液（用3次）用1mol／dm3Tris或1mol／dm3硼酸調(diào)pH值至8.6膠緩沖液：pH值8.61:39稀釋貯存液用1mol／dm3Tris或1mol／dm3硼酸調(diào)pH值至8.6Ⅱ．TBE(Tris-Borate-EDTA)緩沖液，III.TBE(Tris-Borate-Na２EDTA)緩沖液:

pH值8.0,

適用于G6PD，NP，PK，ADH，GAPD，GPD，GLC，GLD，XDH，F(xiàn)UM，PEP-B，PEP-A等酶。電泳條件：恒壓250V，3小時(shí)電極緩沖液：Tris60.6g+硼酸40g+Na２EDTA6g加蒸餾水至1000ml，pH值8.0膠緩沖液：Tris6.06g+硼酸6g+Na２EDTA0.6g加蒸餾水至1000ml，pH值8.0III.TBE(Tris-Borate-Na２EDTA)緩Ⅳ．Borate-NaOH緩沖液:

pH值8.7,適用于Tf，AIB，ALP(AKP)，Sa２，PA，Es電泳條件：恒壓250V，4小時(shí)電極緩沖液：pH值8．70.3mol/dm３硼酸18.6g0.005mol/dm３

NaOH2～4g加水至1000ml，用NaOH調(diào)pH值至8．7膠緩沖液：pH值7.5Tris9.4g檸檬酸1.05g硼酸2g加水至1000ml，調(diào)pH值至7.5Ⅳ．Borate-NaOH緩沖液:

緩沖條件的選擇對(duì)電泳的效果有較大的影響，其中pH值與離子強(qiáng)度是兩個(gè)重要因素。只有pH值和離子強(qiáng)度條件選擇合適，才能既得到較好的分辨率又不降低酶的活性。pH值提高緩沖系統(tǒng)的pH值，可加快電泳速度，使凝膠的pH值與電極緩沖液的pH值之間有一定差距，使電泳時(shí)跑在后面的蛋白質(zhì)分子因電泳基質(zhì)環(huán)境的pH值先降低而前進(jìn)速度減慢，而在前面的蛋白質(zhì)分子仍以高速前進(jìn)，從而拉開距離以提高分辨率。離子強(qiáng)度

增加離子強(qiáng)度，會(huì)使酶蛋白離子因吸引緩沖液中電荷相反的離子而降低泳動(dòng)速度，形成較窄的條帶，有利于提高分辨率；反之，則泳動(dòng)速率快，分辨率不高。緩沖條件的選擇對(duì)電泳的效果有較大的影響，其中5染色方法的選擇

酶的染色原理基于酶的組織化學(xué)法，常用液染和膠染兩種方法。常用染料為噻唑藍(lán)(MTT

1%)或吩嗪鉀硫酸(PMS

1%)。

液染是傳統(tǒng)的染色方法，將膠浸泡在配制好的染液中。這種染色方法使凝膠與染液充分接觸，染色效果好，但藥品用量大。膠染是在少量染液中加入受熱溶解的瓊脂或瓊脂糖溶液，混勻后將混合液平鋪并固定在淀粉凝膠的表面，從而大大節(jié)省了化學(xué)藥品的用量(常為液染的三分之一)，且鋪蓋的熱染液有利于加快酶的反應(yīng)。膠染時(shí)，使用瓊脂較好，因?yàn)榄傊瑑r(jià)格便宜，譜帶不易擴(kuò)散，反應(yīng)速度和酶的活性也沒有明顯的降低。5染色方法的選擇電泳儀電泳槽6電泳電泳儀電泳槽6電泳7酶譜分析

等位酶分析的關(guān)鍵是通過對(duì)電泳后所獲得的酶譜的分析來推斷和確定基因位點(diǎn)和等位基因。7酶譜分析?酶譜照片?酶譜照片二DNA分析技術(shù)特點(diǎn)：

具有更豐富的變異，多態(tài)性高，且所需材料少，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，但取材時(shí)需嚴(yán)格控制DNA的污染，否則分析結(jié)果誤差較大?；具^程包括：

DNA提取、限制性酶切、PCR擴(kuò)增、分子雜交、基因文庫(kù)構(gòu)建、DNA測(cè)序或指紋譜帶測(cè)定。二DNA分析技術(shù)RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisms)、RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)、AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms)、SSR(Simplesequencerepeats)、STS(Sequenc-taggedSite序列位點(diǎn)標(biāo)記)、SNP(SingleNucleotidePolymorphism單核苷酸多態(tài)性)、GISH(Genomicinsituhybridization--基因組原位雜交)、mRNADD(mRNADifferentialDisplay--mRNA差別顯示)、SSH(SuppressionSubtractionHybridization--抑制差減雜交

)、AP-PCR(Arbitray-primerPCR—任意引物PCR)、DAF(DNAamplifiedfingprinting—DNA擴(kuò)增指紋)、SPARs(Singleprimeramplificationreactions)、AMO(AnchoredMicrosatelliteOligonucleotides--加錨微衛(wèi)星寡核苷酸）

目前，常用分子標(biāo)記技術(shù)包括:RFLP(RestrictionFragmentLe1DNA的提取

1)核酸的理化性質(zhì)

A.DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNA純品呈白色粉末或結(jié)晶。

B.DNA、RNA一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。

C.天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，先把DNP抽提出來，除去蛋白

，再除去細(xì)胞中的糖、RNA及無機(jī)離子等，分離DNA。

1DNA的提取DNA的變性與復(fù)性DNA變性：在某些理化因素作用下，DNA分子互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈。監(jiān)測(cè)指標(biāo)為A260增加，并與解鏈程度有一定的關(guān)系。常用的變性方法為加熱。解鏈溫度：DNA變性從開始到完全解鏈?zhǔn)窃谝粋€(gè)相當(dāng)窄的范圍內(nèi)完成的。這一范圍內(nèi)A260達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為解鏈溫度，又稱為融解溫度（meltingtemperature，Tm）。復(fù)性:變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條互補(bǔ)鏈可重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，稱為復(fù)性。熱變性DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，也稱為退火（annealing）。

DNA復(fù)性速度受溫度的影響，復(fù)性時(shí)溫度緩慢下降才可使其重新配對(duì)復(fù)性；如加熱后將其迅速冷卻至4℃以下，則不可能發(fā)生復(fù)性。DNA的變性與復(fù)性DNA變性：在某些理化因素作用下，D2)材料的選擇與提取方法*

DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同。一般來說植物種子的胚DNA含量豐富。也可選用幼嫩的葉片進(jìn)行提取。*不同材料提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。*DNA分子量較小的低等生物的DNA提取比較容易，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。*從高等動(dòng)植物中提取DNA難度大一些。其DNA分子量較大，因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌的DNA，除核DNA外，還有質(zhì)粒DNA等。2)材料的選擇與提取方法

高等動(dòng)植物DNA主要存在于細(xì)胞核與線粒體和葉綠體中，在提取時(shí)有兩個(gè)困難：

①破碎細(xì)胞難；從處死動(dòng)物、分離組織器宮到破碎細(xì)胞費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，在此時(shí)期間DNA可能會(huì)被DNase降解，而動(dòng)物組織，特別是肌肉組織很難破碎，即使是較易破碎的肝、腎等組織也往往因使用組織勻漿器，易造成DNA斷裂。

②分子量大：一般比細(xì)菌的大2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，比病毒的大4—5個(gè)數(shù)量。對(duì)不同生物材料，要根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x提取方法。高等動(dòng)植物DNA主要存在于細(xì)胞核與線粒體和葉3)DNA提取方法(1)濃鹽法

DNP在1MNaCL溶液中溶解度較大，而在0.15mol/LNaCl溶液中溶解度很低(幾乎不溶)；但RNP的溶解度受鹽濃度影響較小，在0.15mol/LNaCl溶液中溶解度仍較大，故可利用0.15MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNP，再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白，再按氯仿---異戊醇法除去蛋白。提取DNA時(shí)，加入適量去污劑，如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA的分離。3)DNA提取方法（2）陰離子去污劑法:

細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合，陰離子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵，所以常用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA。（3）苯酚抽提法:

苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵斷裂，蛋白分子表面含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。

DNA呈十分粘稠狀，可用玻璃慢慢繞成一團(tuán)取出。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)。（2）陰離子去污劑法:好的DNA分離程序應(yīng)符合以下三個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)：（1）所得DNA純度應(yīng)滿足下游操作要求：用于RFLP分析的DNA，其純度要求可用限制性內(nèi)切酶完全酶解并可成功地轉(zhuǎn)移到膜上進(jìn)行Southern雜交；用于PCR分析的DNA則不應(yīng)含干擾PCR反應(yīng)的污染物。（2）所得DNA應(yīng)當(dāng)完整，電泳檢查時(shí)可出現(xiàn)精確性高、重復(fù)性好的遷移帶型。（3）所得的DNA應(yīng)有足夠的量。如研究多個(gè)遺傳標(biāo)記在某一植物居群中的分離情況，要求單株植物中提取的DNA可作100次分析；而從大量植株中篩選一個(gè)單一遺傳標(biāo)記時(shí)，只需在一個(gè)Eppendorf管中微量提取得到的DNA就足夠。如果進(jìn)行大規(guī)模篩選，操作程序還應(yīng)當(dāng)快速、簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉，并盡可能避免使用有毒試劑。好的DNA分離程序應(yīng)符合以下三個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)：

在野外時(shí)，常常采用脫水處理來保存植物材料的DNA。最常用的是用硅膠快速干燥保存樣品，并且干燥后的組織很容易研磨成粉。植物材料中，特別是老的或是經(jīng)逆境處理的材料，含有大量的酚類化合物，這些酚類化合物氧化后易與DNA共價(jià)結(jié)合，使DNA帶棕色或褐色，并能抑制DNA的酶解反應(yīng)。為防止這類情況出現(xiàn)，可以向提取緩沖液中加入2%（W/V）的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或抽提緩沖液中的巰基乙醇的濃度可以提高到2～5%。在野外時(shí)，常常采用脫水處理來保存植物材料的4)實(shí)驗(yàn)室常用DNA提取方法（1）CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）法CTAB可以溶解細(xì)胞膜，能與核酸形成復(fù)合物。CTAB核酸復(fù)合物在高鹽(

>0.7mM

)濃度下可溶，在低鹽濃度(

0.1-0.5mM)下

因溶解度降低而沉淀。植物材料研磨后，在

CTAB的處理下，

65℃水浴可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性，

DNA

被釋放出來并

與CTAB

形成復(fù)合物。氯仿

/

異戊醇

(24:1)

抽提可去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等。降低鹽濃度時(shí)，CTAB核酸復(fù)合物沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶于溶液中。因此通過離心就可將其分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，除去CTAB。4)實(shí)驗(yàn)室常用DNA提取方法EDTA能螯合Mg2+或Mn2+，抑制DNA酶的活性。PVP是酚的絡(luò)合物，能與酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效的去除多酚，減少DNA中酚的污染，同時(shí)它也能與多糖結(jié)合，有效的去除多糖。

β-巰基乙醇是抗氧化劑，可有效的阻止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。用酚-氯仿抽提，去除蛋白、多糖、單寧、色素等雜質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)異丙醇沉淀。Tris(三羥甲基氨基甲烷)-HCL是生物化學(xué)一種常用的緩沖液。EDTA能螯合Mg2+或Mn2+，抑制DNNaCl可提供高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中。另外，高鹽可溶解多糖。氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。乙醇洗劑主要用來除去鹽離子，乙醇會(huì)奪取DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。NaCl可提供高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存母液配制（除標(biāo)注外，均需高壓滅菌）。1）1MTris-HCl（pH8.0）12.11gTris溶于100mlH2O加濃HCl調(diào)pH至8.0（約5.25ml濃HCl）2）0.5MEDTA-Na2（pH8.0）23.26gEDTA-Na2·2H2O+100mlH2O（磁力攪拌）加NaOH（片狀）調(diào)pH至8.0（約2.5gNaOH）在調(diào)pH至8.0以前，EDTA-Na2不溶解3）5MNaCl29.2gNaCl+100mlH2O4）β-巰基乙醇（BME）通常為14.4M（勿高壓滅菌）母液配制（除標(biāo)注外，均需高壓滅菌）。配制10mlCTAB提取液1MTris-HCl 1ml0.5MEDTA-Na2 0.4ml5MNaCl 2.8mlCTAB 0.2gBME 20μl（使用前加入）ddH2O 5.78ml配制30mlTE（pH8.0）（可防止DNA發(fā)生酸解）1MTris-HCl 300μl0.5MEDTA-Na2 60μlddH2O 29.64ml配制10mlCTAB提取液實(shí)驗(yàn)步驟：1．取新鮮葉片放入研缽，加入液氮研磨成細(xì)粉狀。轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管中，加入0.5ml65℃預(yù)熱的CTAB提取液，65℃恒溫水浴30-60min（CTAB在低于15℃時(shí)會(huì)析出沉淀，因此在將其加入冷凍的植物材料中之前必須預(yù)熱），其間不時(shí)輕緩顛倒混勻。如果降解嚴(yán)重或得率太低，可以使用37℃–45℃區(qū)域水浴。2．加入等體積24:1CHCl3/異戊醇，混勻，4℃冷藏靜置10min。3．4℃，10000r/min離心10min，取上清液至新Eppendorf管中。再用等體積24:1酚/氯仿/異戊醇抽提，取上清液。實(shí)驗(yàn)步驟：4.上清液至新的Eppendorf管中，加入2/3倍體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，-20℃靜置至沉淀析出。用玻璃棒(細(xì))挑出成團(tuán)的DNA。5．將DNA挑入Eppendorf管中，用70%乙醇(或無水乙醇)洗滌3次，風(fēng)干。6．將DNA溶于1mlTE中。7．取150μlDNA溶于20倍(或更高倍)體積TE(或ddH2O)中，用TE(或ddH2O)做空白校正。8．測(cè)260nm、280nm、310nm處的OD[dsDNA]=50(OD260–OD310)×稀釋倍數(shù)(μg/ml)DNAOD260/OD280=1.8，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白質(zhì)或酚類污染。4.上清液至新的Eppendorf管中，加入2/3倍體積預(yù)冷（2）SDS法

SDS可溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀。

將分散好的生物組織細(xì)胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚：異戊醇抽提的方法去除蛋白質(zhì)，得到的DNA經(jīng)乙醇沉淀或透析等方法進(jìn)一步純化。相對(duì)而言，過程長(zhǎng)，純度高。而CTAB法相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，

DNA

產(chǎn)量高

；但

純度稍次，適用于一般分子生物學(xué)操作

。（2）SDS法SDS法流程圖

（以動(dòng)物組織為例）

動(dòng)物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法SDS法流程圖（以動(dòng)物組織為例）動(dòng)物組織細(xì)胞裂解上層溶2RNA的提取

RNA的制備與分析對(duì)于了解基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)是必不可少的，也是最常使用的通過cDNA途徑分析細(xì)胞基因表達(dá)的前提。

RNA分析其實(shí)是對(duì)組織細(xì)胞總RNA中的mRNA進(jìn)行分析。通常一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μgRNA，但其中大部分為rRNA及tRNA，而mRNA僅占1%～5%。由于mRNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解，加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在，因而在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性。2RNA的提取RNA酶

RNA實(shí)驗(yàn)的最關(guān)鍵因素是分離到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，反應(yīng)一般不需要輔助因子，并且可耐受多種處理（如煮沸、高壓滅菌等）而不被滅活。

RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。

RNA酶

在實(shí)驗(yàn)中,一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。外源性RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNA酶也會(huì)造成污染。外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶。

在實(shí)驗(yàn)中,一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的一)防止RNA酶污染的措施

1．所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤6h或更長(zhǎng)時(shí)間。

2．塑料器皿可用01%DEPC水(焦磷酸二乙酯)浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機(jī)玻璃器具容易被氯仿腐蝕，故不能使用)。

3．有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。一)防止RNA酶污染的措施

1．所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用4．配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1%DEPC在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)濾膜過濾除菌。

5．操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換。

6．設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。4．配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1%DEPC在37℃處理12h二)常用的RNA酶抑制劑1．焦磷酸二乙酯(DEPC)：

是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。

2．異硫氰酸胍(GITC)

：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。

二)常用的RNA酶抑制劑3．氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

4．RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin)

：從大鼠肝或人胎盤中提取來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。

5．其他

SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。3．氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和

細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法很多，如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現(xiàn)成的總RNA提取試劑盒，可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。分離的總RNA可利用mRNA3’末端含有多聚(A)+的特點(diǎn)，當(dāng)RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法很多，如異硫氰酸胍熱（一）常用總RNA提取-Trizol法

Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA無蛋白和DNA污染。

Trizol的主要成分是異硫氰酸胍和酚，還有8-羥基喹啉、β-巰基乙醇。異硫氰酸胍可溶解蛋白質(zhì)，主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)得以釋放，酚可使蛋白變性，但不能完全抑制RNA酶活性，8-羥基喹啉、β-巰基乙醇可抑制內(nèi)源和外源RNA酶。（一）常用總RNA提取-Trizol法

Trizol法

操作步驟1、將組織在液氮中磨成粉末，每50-100mg組織加入1mlTrizol液進(jìn)行裂解。注意：樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。提取細(xì)胞RNA時(shí)，先離心沉淀細(xì)胞，每5-10╳106個(gè)細(xì)胞加1mlTrizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞；2、將Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，在室溫15~30℃下放置5分鐘

，然后加入氯仿(按1mlTrizol液加入0.2ml的比例)，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒，在室溫下放置2～3分鐘后，12000g(2℃～8℃)離心15分鐘；

操作步驟3、取上層水相置于新的離心管，加入異丙醇（Trizol液體積的1/2)，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。4、棄上清液，按1mlTrizol液加入1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘，棄上清

。5、然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55℃-60℃水溶10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。注意：

1、整個(gè)操作帶口罩及一次性手套，盡可能在低溫下操作。

2、加氯仿前的勻漿液在-70℃可保存一個(gè)月，RNA沉淀在70%乙醇中在4℃可保存一周，-20℃保存一年。3、取上層水相置于新的離心管，加入異丙醇（Trizol液體總RNA定量

RNA在260nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。常用260nm波長(zhǎng)分光測(cè)定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用雙蒸水稀釋RNA樣品n倍并以雙蒸水為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度:RNA(mg/ml)=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(n)/1000。

RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0，若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高則提示RNA有降解。

總RNA定量

RNA在260nm波長(zhǎng)處有

3PCR反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，PCR能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。PCR的最早設(shè)想

1971年Korana提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。3PCR反應(yīng)PCR的實(shí)現(xiàn)

1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件：-----摸板DNA-----寡核苷酸引物-----DNA聚合酶-----合適的緩沖體系-----DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間

PCR的實(shí)現(xiàn)MullisdiscoveredthePCRprocedure,forwhichhewasawardedtheNobelprizein1993.Theprocedurehedevisedhasrevolutionizedmolecularbiology,forensics,andDNAbasedidentificationtechnology.

PCR是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的革命性創(chuàng)舉和里程碑MullisdiscoveredthePCRprocPCR的改進(jìn)與完善

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。PCR的改進(jìn)與完善1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(Thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶，將此酶命名為TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。

TaqDNA多聚酶的特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，提高了其靈敏性。且增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020耐熱DNA聚合酶Saiki（1988）將耐熱DNA聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶OldFaithfulGeyser-YellowstoneNationalParkAnalienandinhospitableplace,characterizedbyextremeheat,spewingsteamintothefrigidair?suchisthesceneofoldfaithfulgeyserinYellowstoneNationalpark.ThisseeminglyprohibitivehabitatishometoThermusaquaticus,thebacteriumfromwhichtheheatstableDNApolymeraseessentialtoPCRisobtained.

OldFaithfulGeyser-Yellowst預(yù)變性(92-95C,2-5m)變性(92-95C,30s)復(fù)性(40-60C,30s)延伸

(72C,30-60s)總延伸

(72C,7m)(25-35)PCR的一般過程經(jīng)過30次循環(huán),擴(kuò)增的DNA片段可達(dá)100萬倍以上。1）PCR技術(shù)基本原理預(yù)變性變性復(fù)性延伸

(72C,30-60s)總延伸

(72PCR技術(shù)基本原理

PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；PCR技術(shù)基本原理

PCR由變性--退火--延③引物的延伸：

DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。③引物的延伸：PCR儀PCR儀PCR原理１變性5’3’5’3’PCR原理１變性5’3’5’3’１復(fù)性PCR原理引物１引物２5’3’5’3’１復(fù)性PCR原理引物１引物２5’3’5’3’１延伸PCR原理１延伸PCR原理２變性PCR原理２變性PCR原理２復(fù)性PCR原理２復(fù)性PCR原理２延伸PCR原理２延伸PCR原理３變性PCR原理３變性PCR原理３復(fù)性PCR原理３復(fù)性PCR原理３延伸PCR原理３延伸PCR原理生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三講-分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)課件PCR反應(yīng)可使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升，最終的DNA擴(kuò)增量可用公式計(jì)算：

Y＝(1＋X)n

其中，Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，大多數(shù)情況下，平臺(tái)期的到來是不可避免的。

PCR反應(yīng)可使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升，最終的DNA2）PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

以DNA為模板的PCR反應(yīng)體系：

模板DNA0.1～2ug

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmolTaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L10×擴(kuò)增緩沖液10ul

加雙蒸水或三蒸水至100ul。2）PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

以DNA為模板的PCR反應(yīng)體參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種，即：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種，即：引物設(shè)計(jì)原則：

（1）引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。

（2）引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

（3）引物量：每條引物的濃度0.1～1umol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。（4）引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物設(shè)計(jì)原則：

（1）引物長(zhǎng)度：15-30b(5)避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物之間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

(6)引物3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

(7)引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

(8)引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無明顯同源性。(5)避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條酶及其濃度：

目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。酶及其濃度：dNTP的質(zhì)量與濃度：

dNTP粉呈顆粒狀，使用時(shí)常配成高濃度溶液，由于dNTP溶液呈酸性，以1MNaOH或1MTris-HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP的質(zhì)量與濃度：?jiǎn)巍㈦p鏈DNA均可。注意模板的完整性，模板降解會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)。RNA作為模板時(shí)，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA作為擴(kuò)增的模板。DNA模板一般100ng/100L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。模板單、雙鏈DNA均可。注意模板的完整性，模板降解會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)模板核酸：

DNA通常采用SDS和蛋白酶K來純化；RNA一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度：

Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。

Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增；濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

模板核酸：PCR反應(yīng)條件

1）變性溫度與時(shí)間：一般情況下，93℃～94℃1分鐘足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間.

變性溫度低，解鏈不完全；溫度過高對(duì)酶的活性有影響。2）退火溫度與時(shí)間：對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，使DNA雙鏈結(jié)合。

PCR反應(yīng)條件

1）變性溫度與時(shí)間：

引物的退火溫度可通過以下公式計(jì)算：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

在引物長(zhǎng)度大于20bp時(shí)：復(fù)性溫度=

62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般30～60sec，足以使引物與模板完全結(jié)合。

引物的退火溫度可通過以下公式計(jì)算：

3）延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度一般在70～75℃之間，常用72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。（70～80℃150核苷酸/S/酶分子；70℃60核苷酸/S/酶分子；55℃24核苷酸/S/酶分子）延伸時(shí)間，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。

4）循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

3）延伸溫度與時(shí)間：PCR反應(yīng)特點(diǎn)：

1）特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對(duì)原則；

③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。PCR反應(yīng)特點(diǎn)：

1）特異性強(qiáng)2）靈敏度高

PCR反應(yīng)能將皮克(pg=10-12g)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。

3）簡(jiǎn)便、快速

一般在2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

4）對(duì)標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。2）靈敏度高4PCR產(chǎn)物分析PCR產(chǎn)物的分析，依據(jù)研究對(duì)象和目的可采用以下分析方法：

凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB染色，紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致，特別是多重PCR，應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)計(jì)的大小。

瓊脂糖凝膠電泳：通常應(yīng)用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。

酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。4PCR產(chǎn)物分析分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法。

Southern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

斑點(diǎn)雜交：將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點(diǎn)，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)RFLP技術(shù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms)是最早應(yīng)用的一種DNA標(biāo)記技術(shù)，該方法利用限制性內(nèi)切酶識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并在特定位點(diǎn)將DNA切開。不同種生物的同一基因堿基組成和序列是不同的，從而使限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別的序列發(fā)生變化，結(jié)果產(chǎn)生新的特定酶切位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生不同的DNA片段。RFLP技術(shù)不同個(gè)體DNA的提取酶切凝膠電泳分開DNA片段轉(zhuǎn)膜

Southern雜交

數(shù)據(jù)分析技術(shù)路線不同個(gè)體DNA的提取酶切凝膠電泳分開DNA片段轉(zhuǎn)膜Sout基本步驟1、用限制性內(nèi)切酶消化從生物中提取的DNA模板DNA為不同長(zhǎng)度的片段；2、用瓊脂糖電泳分離開并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或尼龍膜上，然后用專一序列的標(biāo)記DNA探針DNA在膜上與模板DNA雜交，3、最后用自顯影或顯色或發(fā)光分析顯示與探針同源的DNA片段；基本步驟

因?yàn)橄拗泼缸R(shí)別專一的堿基序列，因此DNA序列的變異會(huì)導(dǎo)致酶切點(diǎn)的消失或增加，限制片段的長(zhǎng)度發(fā)生變化，顯示多樣性。缺點(diǎn)

RFLP分析對(duì)樣品純度要求較高，樣品用量大，且RFLP多態(tài)信息含量低，多態(tài)性水平過分依賴于限制性內(nèi)切酶的種類和數(shù)量，加之RFLP分析技術(shù)步驟繁瑣、工作量大、成本較高，所以其應(yīng)用受到了一定的限制因?yàn)橄拗泼缸R(shí)別專一的堿基序列，因此DNA序RFLP原理圖RFLP原理圖生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三講-分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)課件生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三講-分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)課件RAPD技術(shù)隨機(jī)擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性(randomamplifiedpolymorphicDNAs)特點(diǎn)：對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)。利用隨機(jī)選擇的寡聚核苷酸（一般10bp)作引物，通過對(duì)基因組DNA的PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖膠上電泳分離，銀染或溴化乙錠（EB）染色，得到DNA的多態(tài)性標(biāo)記。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，快速成本低

缺點(diǎn)：可重復(fù)性差RAPD技術(shù)DNA的提取

PCR反應(yīng)

凝膠電泳

選擇隨機(jī)引物

圖譜分析

DNA的提取PCR反應(yīng)凝膠電泳選擇生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三講-分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)課件生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三講-分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)課件AFLP技術(shù)

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）是建立在基因組限制性片段基礎(chǔ)上的PCR擴(kuò)增。由于不同物種的基因組DNA大小不同，基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生分子量大小不同的限制性片段。與RFLP的主要區(qū)別是用PCR代替Southern雜交，它兼有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，且具有快速、靈敏、穩(wěn)定、所需DNA量少、多態(tài)性檢出率高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。AFLP技術(shù)

使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，用含有選擇性堿基的引物對(duì)摸板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性，只有那些限制性位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無來檢出多態(tài)性.使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作

AFLP的原理

DNA提取兩種限制性內(nèi)切酶酶切DNA寡聚核苷酸接頭的連接對(duì)限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析AFLP的AFLP技術(shù)優(yōu)點(diǎn)

1、所需DNA量少，AFLP反應(yīng)對(duì)模板濃度的變化不敏感。2、可重復(fù)性好。高質(zhì)量的DNA和過量的酶可以克服因DNA酶切不完全而產(chǎn)生的失真，PCR中較高的退火溫度和較長(zhǎng)的引物可將擴(kuò)增中的錯(cuò)誤減少到最低限度。

3、多態(tài)性強(qiáng)。AFLP通過改變限制性內(nèi)切酶和選擇性堿基的種類與數(shù)目，來調(diào)節(jié)擴(kuò)增的條帶數(shù)，具有較強(qiáng)的多態(tài)分辨能力。

4、分辨率高。AFLP擴(kuò)增片段短，適合于變性序列凝膠上電泳分離，因此片段多態(tài)性檢出率高。缺點(diǎn)1、試劑盒價(jià)格昂貴，試驗(yàn)成本高。2、對(duì)DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高，應(yīng)用受到限制。AFLP技術(shù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)

微衛(wèi)星SSR（simplesequencerepeats）原理：微衛(wèi)星DNA是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡(jiǎn)單重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)單元的長(zhǎng)度在1—10bp之間，常見的微衛(wèi)星如TGTG……TG=(TG)n或AATAAT……AAT=(AAT)n等，不同數(shù)目的核心序列呈串聯(lián)重復(fù)排列，而呈現(xiàn)出長(zhǎng)度多態(tài)性。在基因組中，因每個(gè)SSR序列的基本單元重復(fù)次數(shù)在不同基因型間差異很大，從而形成其座位的多態(tài)性。而且每個(gè)SSR座位兩側(cè)一般是相對(duì)保守的單拷貝序列，據(jù)此可設(shè)計(jì)引物，其關(guān)鍵是首先要了解SSR座位的側(cè)翼序列(FlankingRegion)，尋找其中的特異保守區(qū)。微衛(wèi)星SSR（simplesequencerepe生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三講-分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)課件技術(shù)路線：建立DNA文庫(kù)，篩選鑒定微衛(wèi)星DNA克隆，然后測(cè)定這些克隆的序列，設(shè)計(jì)特異性引物來擴(kuò)增SSR序列。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色，通過比較譜帶的相對(duì)遷移距離，便可知不同個(gè)體在某個(gè)SSR座位上的多態(tài)性。技術(shù)路線：生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三講-分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)課件微衛(wèi)星SSR的優(yōu)點(diǎn)：（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個(gè)基因。據(jù)估計(jì)，在基因組中平均30—50kb就存在一個(gè)微衛(wèi)星。（2）微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性。與RFLP標(biāo)記相比SSR檢測(cè)的多態(tài)性頻率要高得多

。（3）微衛(wèi)星檢測(cè)容易、重復(fù)性較好、省時(shí)，適合于進(jìn)行自動(dòng)化分析。一個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)一般可在24h內(nèi)完成，且可同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)的檢測(cè)。（4）所需DNA量少，對(duì)DNA質(zhì)量要求不高。微衛(wèi)星SSR的優(yōu)點(diǎn)：微衛(wèi)星的缺點(diǎn)：由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需要知道重復(fù)序列兩端的序列信息，要克隆足夠數(shù)量的SSR，并對(duì)基因進(jìn)行測(cè)序和設(shè)計(jì)引物，沒有足夠的投資、人力和時(shí)間，是不可能實(shí)現(xiàn)的。原位雜交（GISH或FISH）利用生物素或地高辛等非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針的DNA探針與染色體上的DNA雜交，在染色體上直接進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記技術(shù)。標(biāo)記物：脫氧尿嘧啶三磷酸

Bio-dUTP(生物素)

Dig-dUTP(地高辛)微衛(wèi)星的缺點(diǎn)：染色體FISH探針整條染色體涂染探針染色體重復(fù)序列探針染色體專一位點(diǎn)探針基本過程：1、染色體標(biāo)本制備2、探針制備3、雜交4、顯微觀察染色體FISH探針整條染色體涂染探針基本過程：整條染色體涂染整條染色體涂染通過整條染色體涂染判斷易位染色體通過整條染色體涂染判斷易位染色體染色體重復(fù)序列探針染色體重復(fù)序列探針染色體專一位點(diǎn)探針染色體專一位點(diǎn)探針

第三講分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

分子生態(tài)學(xué)是上世紀(jì)90年代初新興的一門生態(tài)學(xué)分支學(xué)科，應(yīng)用分子生物學(xué)的原理和方法來研究生命系統(tǒng)與環(huán)境系統(tǒng)相互作用的生態(tài)機(jī)理及其分子機(jī)制的科學(xué)，闡明自然種群和引進(jìn)種群與環(huán)境之間的聯(lián)系，評(píng)價(jià)重組生物體釋放對(duì)環(huán)境的影響（Smith,1993)。

分子生態(tài)學(xué)主要研究?jī)?nèi)容：物種起源與進(jìn)化、轉(zhuǎn)基因生物的生態(tài)學(xué)效應(yīng)評(píng)估、瀕危物種的保護(hù)、有害動(dòng)物的控制、醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用等。第三講分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

分子生態(tài)分子生態(tài)學(xué)的研究方法

主要包括兩大類：基于DNA層次的研究方法和基于蛋白質(zhì)層次的研究方法。

DNA層次的主要研究對(duì)象是線粒體DNA、葉綠體DNA、核糖體DNA、基因組DNA；蛋白質(zhì)層次的研究多采用多位點(diǎn)等位酶技術(shù)。分子生態(tài)學(xué)的研究方法主要包括兩大類：分子標(biāo)記的種類與歷史蛋白質(zhì)：同工酶(等位酶)：六十年代以來核苷酸序列和片段：tRNA（1965）1980年以來：RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)）1984年以來：SSR(短重復(fù)序列標(biāo)記)1990年以來：RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài))1993年以來：AFLP(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài))分子標(biāo)記的種類與歷史蛋白質(zhì)：同工酶(等位酶)：六十年代以來一等位酶技術(shù)酶是基因編碼的產(chǎn)物，在電場(chǎng)中遷移率的改變可反映酶蛋白的大小、構(gòu)形和肽鏈氨基酸的序列變化，即編碼DNA順序上的變化，通過分析酶譜的變化可獲得所需的遺傳信息。在酶譜分析中，等位酶是常用的分析工具。等位酶是同一基因位點(diǎn)的不同等位基因所編碼的同一種酶的不同形式，等位酶作為基因表達(dá)的產(chǎn)物間接反映酶基因位點(diǎn)及等位基因的變化，是衡量遺傳變異的重要遺傳標(biāo)記。一等位酶技術(shù)

在種內(nèi)水平上，

等位酶可作為一種穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記。根據(jù)等位酶譜帶的遺傳分析確定出每種等位基因在居群中的頻率，從而計(jì)算出它們的遺傳相似度或遺傳距離，對(duì)種群的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)做出估計(jì)，測(cè)量種群的遺傳多樣性以及各種群間的遺傳距離。等位酶技術(shù)主要應(yīng)用于居群的遺傳結(jié)構(gòu)及其時(shí)空變化、居群分化和物種形成、種間關(guān)系、遺傳育種、生物多樣性、推斷雜種或多倍體的親本、類群間的親緣性等領(lǐng)域。在種內(nèi)水平上，等位酶可作為一種穩(wěn)定的遺傳標(biāo)等位酶技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：操作相對(duì)簡(jiǎn)單，花費(fèi)少，統(tǒng)計(jì)方法標(biāo)準(zhǔn)，并且有大量的前人資料可以借鑒。缺點(diǎn)：但對(duì)一些狹域分布的地方種群，往往缺乏多態(tài)性的位點(diǎn)，無法進(jìn)行等位酶分析（至少需分析10-20個(gè)獨(dú)立分離的多態(tài)性位點(diǎn)，才能達(dá)到統(tǒng)計(jì)的可信度)。另外分析時(shí)一定要保持酶的活性。等位酶技術(shù)材料的采集研磨和酶的提取酶的保存凝膠制備電泳凝膠切片酶的組織化學(xué)染色酶譜的記錄與分析數(shù)據(jù)分析等位酶分析的過程材料的