KJ-柱后衍生原理和關(guān)鍵點(diǎn)(共32張PPT)

上海德諾產(chǎn)品檢測(cè)有限公司

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農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(上海)中國上海江場(chǎng)西路1550號(hào)3號(hào)樓網(wǎng)址：第1頁，共32頁。氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生

簡(jiǎn)介及關(guān)鍵點(diǎn)

主講：何亞斌

2012.07第2頁，共32頁。衍生化的定義

衍生化是一種利用化學(xué)變換把化合物轉(zhuǎn)化成類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。一般來說，一個(gè)特定功能的化合物參與衍生反應(yīng)，溶解度，沸點(diǎn)，熔點(diǎn)，聚集態(tài)或化學(xué)成分會(huì)產(chǎn)生偏離。由此產(chǎn)生的新的化學(xué)性質(zhì)可用于量化或分離。第3頁，共32頁。衍生化的目的衍生化最為主要的目的就是提高目的物的可檢測(cè)性。把難于分析的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相似但易于分析的物質(zhì)，便于量化和分離。對(duì)于GC來講，多數(shù)是為了增強(qiáng)目的物揮發(fā)性或者改善目的物極性;對(duì)于HPLC來講多數(shù)是為了提高檢測(cè)器對(duì)目的物的響應(yīng)。衍生化常用的反應(yīng)有酯化、?；?、烷基化、硅烷化、硼烷化、環(huán)化和離子化等

第4頁，共32頁。衍生化試劑簡(jiǎn)單的說:它能幫你將不能分析的樣品通過衍生化試劑反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可分析的化合物.種類:烷基化試劑、硅烷化試劑、?；噭╊悺晒庋苌噭?、紫外衍生化試劑、苯甲酰氯為衍生化試劑、羥基衍生化試劑、手性衍生化試劑、氨基衍生化試劑。第5頁，共32頁。判斷衍生化反應(yīng)的指標(biāo)1、反應(yīng)是否迅速、定量進(jìn)行，反應(yīng)重復(fù)性好壞，反應(yīng)條件是否溫和，是否容易操作。2、反應(yīng)選擇性高，最好只于目標(biāo)化合物反應(yīng)。3、衍生化產(chǎn)物只有一種，反應(yīng)的副產(chǎn)物和過量的衍生化試劑應(yīng)不干擾目標(biāo)化合物的分離和檢測(cè)。

4、衍生化試劑通用性好，價(jià)廉易得。

第6頁，共32頁。衍生化方法應(yīng)用不當(dāng)?shù)谋锥?、柱上衍生化可能損傷色譜柱。

2、某些衍生化試劑需氮?dú)獯蹈伞?/p>

3、衍生化不完全，影響靈敏度。

4、衍生化試劑不當(dāng)，產(chǎn)物分子量過大。

第7頁，共32頁。氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生－注意點(diǎn)其它應(yīng)用：

聚醚抗生素、串珠鐮孢毒素、貝毒等毒素、單端孢莓稀毒枝菌素和赭曲霉毒素、生物胺、甲醛、類固醇等。衍生化常用的反應(yīng)有酯化、?；⑼榛?、硅烷化、硼烷化、環(huán)化和離子化等氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生對(duì)于HPLC來講多數(shù)是為了提高檢測(cè)器對(duì)目的物的響應(yīng)。氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生反應(yīng)器1：100℃，0.需要額外的設(shè)備，反應(yīng)器可造成峰展寬，降低分辨率。4、衍生化試劑不當(dāng)，產(chǎn)物分子量過大。從是否與儀器聯(lián)機(jī)的角度來分有：需要額外的設(shè)備，反應(yīng)器可造成峰展寬，降低分辨率。相對(duì)自由地選擇反應(yīng)條件；對(duì)于GC來講，多數(shù)是為了增強(qiáng)目的物揮發(fā)性或者改善目的物極性;柱前衍生是在經(jīng)過分析柱前使分析物與衍生劑反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在分析柱上實(shí)現(xiàn)分離，實(shí)際分離的是衍生產(chǎn)物，檢測(cè)的也是衍生產(chǎn)物;水解試劑和衍生試劑不可以弄錯(cuò)，如果反發(fā)了則無法衍生；衍生化分類1.從是否形成共價(jià)鍵來說，可分為：標(biāo)記和非標(biāo)記反應(yīng)。標(biāo)記反應(yīng)是在反應(yīng)過程中，被分析物與標(biāo)記試劑之間生成共價(jià)鍵；所有其它類型的反應(yīng)，如形成離子對(duì)、光解、氧化還原、電化學(xué)反應(yīng)等都是非標(biāo)記反應(yīng)。第8頁，共32頁。2.從衍生反應(yīng)的場(chǎng)所來說，可分為：柱前衍生化(pre-columnderivatization)；柱上衍生化(on-columnderivatization)；柱后衍生化(post-columnderivatization)三種。3.從是否與儀器聯(lián)機(jī)的角度來分有：在線(on-line)、離線(off-1ine)和旁線(at-line)(自動(dòng)化)三種。目前在HPLC中以離線的柱前衍生法(簡(jiǎn)稱柱前衍生法)與在線的柱后衍生法(簡(jiǎn)稱柱后衍生法)使用居多，旁線衍生化方法是發(fā)展方向。第9頁，共32頁。柱前衍生和柱后衍生定義柱前衍生是在經(jīng)過分析柱前使分析物與衍生劑反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在分析柱上實(shí)現(xiàn)分離，實(shí)際分離的是衍生產(chǎn)物，檢測(cè)的也是衍生產(chǎn)物;柱后衍生是分離物在分析柱中實(shí)現(xiàn)分離后，在衍生池內(nèi)與衍生劑反應(yīng)，在柱子中分離的是目的物，在檢測(cè)器處檢測(cè)的衍生產(chǎn)物。

第10頁，共32頁。柱前衍生法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)自由地選擇反應(yīng)條件；不存在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的限制；衍生化的副產(chǎn)物可進(jìn)行預(yù)處理以降低或消除其干擾；容易允許多步反應(yīng)的進(jìn)行；有較多的衍生化試劑可選擇；不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：形成的副產(chǎn)物可能對(duì)色譜分離造成較大困難；在衍生化過程中，容易引入雜質(zhì)或干擾峰，或使樣品損失。第11頁，共32頁。柱后衍生的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：形成副產(chǎn)物不重要，反應(yīng)不需要完全，產(chǎn)物也不需要高的穩(wěn)定性，只需要有好的重復(fù)性即可；被分析物可以在其原有的形式下進(jìn)行分離，容易選用已有的分析方法。缺點(diǎn)：對(duì)于一定的溶劑和有限的反應(yīng)時(shí)間來說，目前只有有限的反應(yīng)可供選擇；需要額外的設(shè)備，反應(yīng)器可造成峰展寬，降低分辨率。第12頁，共32頁。柱后衍生技術(shù)的應(yīng)用

氨基酸；鏈霉素以及其他氨基糖苷類抗生素，包括：慶大霉素、阿泊拉霉素、新霉素等。氨基甲酸酯：

涕滅威亞砜、涕滅威砜、草氨酰、滅多蟲、3-羥基呋喃丹、涕滅威、殘殺威、呋喃丹、西維因（胺甲萘）、1-萘酚、滅蟲威、BDMC內(nèi)標(biāo)草甘磷以及百草枯、敵草快等除草劑黃曲霉毒素等毒素。其它應(yīng)用：

聚醚抗生素、串珠鐮孢毒素、貝毒等毒素、單端孢莓稀毒枝菌素和赭曲霉毒素、生物胺、甲醛、類固醇等。第13頁，共32頁。如何實(shí)現(xiàn)柱后衍生第14頁，共32頁。第15頁，共32頁。衍生試劑第16頁，共32頁。原理第17頁，共32頁。氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生原理氨基甲酸酯類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)中均含有下N-甲基氨基甲酰基。第18頁，共32頁。第19頁，共32頁。第20頁，共32頁。氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生氨基甲酸酯類農(nóng)藥按照在C18、C8柱上的洗脫順序流出。分離后的氨基甲酸酯農(nóng)藥首先在100℃下在NaOH作用下水解釋放出醇，碳酸鹽和甲胺。在第二個(gè)柱后反應(yīng)中甲胺與鄰苯二甲醛（OPA和2-巰基乙醇反應(yīng)生成有強(qiáng)熒光吸收的1-甲基-2-蚓哚類化合物，被熒光檢測(cè)器檢測(cè)且具有很低的檢測(cè)限，滿足殘留分析方法的要求。第21頁，共32頁。氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生原理第22頁，共32頁。氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生柱后衍生系統(tǒng)圖第23頁，共32頁。氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生氨基甲酸酯分析的柱后條件：

衍生試劑1：水解衍生試劑CB130衍生試劑2：100mgOPA,2gThiofluor溶解于950mLCB910反應(yīng)器1：100℃，0.5mL反應(yīng)器2：環(huán)境溫度衍生試劑流速：0.3mL/min

檢測(cè)條件：熒光檢測(cè)器：λex330nm,λem465nm氨基甲酸酯分離柱（4.6×250mm）,C18,5um第24頁，共32頁。反應(yīng)試劑的準(zhǔn)備OPA衍生試劑水解試劑第25頁，共32頁。從是否形成共價(jià)鍵來說，可分為：標(biāo)記和非標(biāo)記反應(yīng)。簡(jiǎn)單的說:它能幫你將不能分析的樣品通過衍生化試劑反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可分析的化合物.不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。其它應(yīng)用：

聚醚抗生素、串珠鐮孢毒素、貝毒等毒素、單端孢莓稀毒枝菌素和赭曲霉毒素、生物胺、甲醛、類固醇等。鏈霉素以及其他氨基糖苷類抗生素，包括：慶大霉素、阿泊拉霉素、新霉素等。不存在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的限制；氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生柱后衍生化(post-columnderivatization)三種。熒光檢測(cè)器：λex330nm,λem465nm衍生化方法應(yīng)用不當(dāng)?shù)谋锥税被姿狨ヮ愞r(nóng)藥的柱后衍生對(duì)于GC來講，多數(shù)是為了增強(qiáng)目的物揮發(fā)性或者改善目的物極性;柱后衍生化(post-columnderivatization)三種。

反應(yīng)試劑的準(zhǔn)備

1.水解試劑

用甲醇徹底清洗兩個(gè)反應(yīng)試劑瓶，并用甲醇清洗浸在反應(yīng)試劑中的管線。水解試劑不需要制備，直接將水解試劑(CB930)倒入到標(biāo)有水解試劑標(biāo)簽的反應(yīng)試劑瓶中。注！水解試劑不建議自己制備，因?yàn)楹茈y得到足夠純度的NaOH。第26頁，共32頁。反應(yīng)試劑的準(zhǔn)備2.OPA試劑a.倒入945mLOPA稀釋劑（CB910）到反應(yīng)試劑瓶中（留下5mL備用）。b.蓋上瓶蓋，打開Vent閥，打開氣源，用惰性氣體鼓泡至少10分鐘。c.溶解100mgOPA到大約10mLHPLC級(jí)甲醇中。d.關(guān)閉氣源，移走瓶蓋，加入OPA溶液到已經(jīng)脫氧的OPA稀釋劑瓶中。e.溶解2gThiofluor(Cat.No.3700-2000)到剛才剩下的5mLOPA稀釋劑中，然后加入到反應(yīng)試劑中。f.蓋上瓶蓋并打開氣源，連續(xù)鼓泡1min。輕搖試劑瓶直到完全混合。第27頁，共32頁。注意!如果沒有Thiofluor(N,N-二甲基-2-巰基乙胺鹽酸鹽)，移取1mL2-巰基乙醇。處理2-巰基乙醇應(yīng)該在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，因其易揮發(fā)和不愉快的臭味。不推薦自己制備OPA稀釋劑，因?yàn)榕鹚徕c（任何級(jí)別）含有過量的重金屬和不溶物，這些雜質(zhì)最終會(huì)沉淀在反應(yīng)器和流通池內(nèi)。水解試劑比較穩(wěn)定，而OPA試劑易于氧化且一直降解。在惰性氣體體密封下，OPA試劑可以維持兩周而沒有明顯的活性降低。第28頁，共32頁。清洗系統(tǒng)衍生試劑換成水沖洗管路30min；反應(yīng)池溫度設(shè)為小于60℃；將水換成水/甲