蛋白質(zhì)分離純化與表征

關(guān)于蛋白質(zhì)分離純化與表征第1頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六蛋白質(zhì)分離純化是利用其特性的差異分子的大小和形狀酸堿性質(zhì)溶解度吸附性質(zhì)對(duì)配體分子的特異生物學(xué)親和力蛋白質(zhì)純化應(yīng)根據(jù)研究工作和生產(chǎn)的具體目的和要求，制訂分離純化的合理程序。第2頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六

蛋白質(zhì)含有酸/堿AA殘基具有兩性

堿/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)第3頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六

蛋白質(zhì)的分子量一般在一萬至一百萬道爾頓之間

1道爾頓＝1×C12絕對(duì)質(zhì)量/12≈1.66×10-27千克二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀第4頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的原理和方法（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量（二）滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（三）蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù)（四）沉降分析法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（五）凝膠過濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量第5頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最小分子量1、測(cè)定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子最低相對(duì)分子質(zhì)量=100*55.8/鐵的百分含量例如肌紅蛋白含鐵量為0.335%，那么其最低相對(duì)分子質(zhì)量就是55.8/0.335×100=16700第6頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六（五）凝膠過濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)分子通過凝膠柱的速度并不取決于分子的質(zhì)量，而是它的斯托克半價(jià)。如果某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體過柱速度相同，則認(rèn)為具有與該球體相同的半徑，稱斯托克半徑第7頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六蛋白質(zhì)混合樣

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知Mr和斯托克半徑）和待測(cè)蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球形）第8頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)顆粒在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于：所帶電荷分子量分子形狀但是如果在該系統(tǒng)中添加SDS和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的相對(duì)分子質(zhì)量。第9頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六第10頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對(duì)分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵第11頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六第12頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六第13頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六第14頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六蛋白質(zhì)分子的形狀蛋白質(zhì)分子在溶液中的形狀或構(gòu)象的信息，可借助其摩擦系數(shù)與理想球體的摩擦系數(shù)之比，也就是所謂的蛋白質(zhì)分子的摩擦比來推測(cè)。摩擦比越大，蛋白質(zhì)分子的不對(duì)稱性越高。第15頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）膠體性質(zhì)（colloidalsystem）膠體溶液的特點(diǎn)：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液第16頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.水膜彈性3.質(zhì)點(diǎn)的大小（1～100nm）蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過半透膜等性質(zhì)第17頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六（二）蛋白質(zhì)的沉淀

Pr從膠體溶液中析出任何破壞穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的因素都可能使蛋白質(zhì)沉淀I可逆沉淀溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當(dāng)條件下可重新溶解

——非變性沉淀pI沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等第18頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六

不可逆沉淀強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解——變性沉淀如加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等Ⅱ第19頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六1.鹽析法加入大量中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉）脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性第20頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解—鹽溶原因？鹽溶—鹽析分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶第21頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出原因？蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析（（NH4）2SO4）第22頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六2.有機(jī)溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用3.等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)分子帶有相同數(shù)量的正負(fù)電荷，因此，蛋白質(zhì)分子相互吸引，從而聚集沉淀。第23頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六4.重金屬鹽沉淀與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽5.生物堿試劑和某些酸類沉淀與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽6.加熱變性沉淀天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)第24頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.前處理：因動(dòng)/植物/細(xì)菌而異2.粗分級(jí)分離：采用鹽析/等電點(diǎn)沉淀/有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法3.細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶是最后步驟第25頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

1、透析和超過濾利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其與小分子物質(zhì)分開半透膜為玻璃紙或纖維素材料第26頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機(jī)透析液加壓血液第27頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六2、密度梯度（區(qū)帶）離心用一定的介質(zhì)（如蔗糖）在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將蛋白質(zhì)混合液置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場(chǎng)的作用使蛋白質(zhì)分層、分離。第28頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六3、凝膠過濾3.凝膠過濾第29頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六（二）利用溶解度差別的純化方法1.等電點(diǎn)沉淀

調(diào)整溶液pH

不同蛋白在各自

pI處依次沉淀

2.鹽溶和鹽析3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法降低介電常數(shù)爭(zhēng)奪水化膜影響溶解度的外部因素有：pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度。4.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶劑度的影響第30頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六（三)根據(jù)電荷不同的分離方法1.電泳原理：蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為0分子大小不同，電場(chǎng)中移動(dòng)速度也不同第31頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六平板電泳第32頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六等電聚焦電泳第33頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六雙向電泳第34頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六離子交換層析第35頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六（四）利用蛋白質(zhì)選擇性吸附的性質(zhì)羥磷石灰層析疏水作用層析第36頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六（五）利用對(duì)配體的特異生物學(xué)

親和力的純化方法親和色譜顆粒具有極強(qiáng)的專一性第37頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六第38頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六（六）高效液相層析和快速蛋白質(zhì)液相層析多種類型的柱層析都可用HPLC來代替，例如分配層析，離子交換層析，吸附層析以及凝膠過濾。第39頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六六、蛋白質(zhì)含量測(cè)定和純度鑒定（一）蛋白質(zhì)含量測(cè)定常用方法：凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法、染料結(jié)合法（bradford或考馬斯亮藍(lán)法）和膠體金測(cè)定法。Lowry法，主要是利用folin-酚試劑能與Cu+離子反應(yīng)，而Cu+是由蛋白質(zhì)的巰基或酚基氧化Cu2+而產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)：含兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵化合物與CuSO4溶液都能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)省市紫紅色或藍(lán)紫色復(fù)合物。第40頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六（二）蛋白質(zhì)純度鑒定通常采用電泳、沉降、HPLC和溶解度分析。第41頁，共43頁，2022年，5月20日，7點(diǎn)45分，星期六凝膠過濾和SDS均是利用凝膠，按照分子大小分離蛋白質(zhì)的，為什么凝膠過濾時(shí)，蛋白質(zhì)分子越小，洗脫速度越慢，而在SDS中，蛋白質(zhì)分子越小，遷移速度越快凝膠過濾時(shí)，凝膠顆粒排阻Mr較大的蛋白質(zhì)，僅允許Mr較小的蛋白質(zhì)進(jìn)入