組織培養(yǎng)細胞的生物學課件

組織培養(yǎng)細胞的生物學第二章組織培養(yǎng)細胞的生物學第二章Contents細胞生存環(huán)境和代謝附著底物人工培養(yǎng)基教學內(nèi)容1235體內(nèi)、外細胞的差異和分化體外培養(yǎng)細胞的分型細胞相互關(guān)系細胞系（株）的建立87643組織培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程2022/11/272Contents細胞生存環(huán)境和代謝附著底物人工培養(yǎng)基教學內(nèi)容在個體發(fā)生過程中，細胞通過不斷的生長和繁殖，數(shù)量增多，與此同時發(fā)生著分化。分化：及細胞在形態(tài)和功能上由一般發(fā)展到特殊的過程，由于分化的結(jié)果，形成了各種組織和器官。一、體內(nèi)、外細胞的差異和分化2022/11/273在個體發(fā)生過程中，細胞通過不斷的生長和繁殖，數(shù)量增多，因模擬的培養(yǎng)條件與體內(nèi)實際情況仍有很大差異，易發(fā)生以下變化：分化現(xiàn)象減少，形態(tài)和功能趨于單一，生存一定時間后衰退死亡或發(fā)生轉(zhuǎn)化，變成有無限生長能力的連續(xù)細胞系或惡性細胞系。如：腺細胞分泌機能喪失，肌細胞纖維細胞化。原因：細胞在人工培養(yǎng)以后，可能導(dǎo)致很多基因關(guān)閉，而導(dǎo)致分化停止、功能喪失?？梢岳眠@一點，來研究基因表達和調(diào)控。（一）差異2022/11/274因模擬的培養(yǎng)條件與體內(nèi)實際情況仍有很大差異，易發(fā)生以下變化：體外培養(yǎng)細胞分化能力并未完全喪失，只是因環(huán)境改變其分化表現(xiàn)和原體內(nèi)不同。如：體內(nèi)：成纖維細胞、骨細胞→膠原體外：成纖維細胞、上皮細胞、神經(jīng)細胞、腫瘤細胞→膠原。如何揭示細胞分化的條件，闡明分化調(diào)控的機制是主要的。（二）分化2022/11/275體外培養(yǎng)細胞分化能力并未完全喪失，只是因環(huán)境改變其分化表現(xiàn)和據(jù)能否貼附在支持物上生長的性質(zhì)，分：2、懸浮型(ES細胞，老鼠，初生培養(yǎng)；熒光，DAPI染色劑)1、貼附型(心肌細胞，老鼠，初生培養(yǎng))二、體外培養(yǎng)細胞的分型2022/11/276據(jù)能否貼附在支持物上生長的性質(zhì)，分：2、懸浮型(ES細胞，老培養(yǎng)時能貼附在支持物上生長，大多數(shù)細胞呈貼附型生長。特點：1、分化現(xiàn)象變得不顯著，易失去它們在體內(nèi)時的原有特征。2、形態(tài)上常表現(xiàn)單一化的現(xiàn)象，并常反映其胚層起源，類似所謂“返祖”現(xiàn)象。如：起源于內(nèi)、外胚層的細胞多呈上皮型。

中胚層------------------呈成纖維細胞型。體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)常表現(xiàn)有一般化的傾向。因此，判定細胞形態(tài)很難按體內(nèi)細胞標準確定，僅大致分成以下幾類：（一）貼附型2022/11/277培養(yǎng)時能貼附在支持物上生長，大多數(shù)細胞呈貼附型生長。（一）貼與體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)相似而得名。心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮（中胚層間充質(zhì)起源）都呈此形態(tài)。成纖維細胞型1、成纖維細胞型2022/11/278與體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)相似而得名。心肌、平滑肌、成骨細

起源于內(nèi)、外胚層細胞。如：皮膚表皮，消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等。

上皮細胞型2、上皮細胞型2022/11/279起源于內(nèi)、外胚層細胞。上皮細胞型2、上皮細胞型2022/此型不穩(wěn)定，有時難與其它細胞相區(qū)別。游走細胞型3、游走細胞型2022/11/2710此型不穩(wěn)定，有時難與其它細胞相區(qū)別。游走細胞型3、游走細胞型除上述三型外，其它難以確定它們規(guī)律和形態(tài)的，統(tǒng)歸為“多形細胞型”。如：神經(jīng)組織的細胞。多型細胞型4、多形細胞型2022/11/2711除上述三型外，其它難以確定它們規(guī)律和形態(tài)的，統(tǒng)歸為“多形細培養(yǎng)細胞的形態(tài)受多種因素的影響，如：溫度，二氧化碳，酸、堿、密度等。如：Hela細胞，本屬上皮型，但過酸、過堿變成梭形。上皮細胞數(shù)量少時，呈星形或三角形。數(shù)量多時，呈上皮型。它來源于美國的HelenLane，她1951年死于子宮頸癌2022/11/2712培養(yǎng)細胞的形態(tài)受多種因素的影響，它來源于美國的Hele培養(yǎng)時，不貼附與支持物上，而呈懸浮狀態(tài)生長。如：某些癌細胞、白細胞。其優(yōu)點：細胞生存空間大，容許長時間生長，能繁殖多量細胞，便于做細胞代謝研究。S180細胞（二）懸浮型2022/11/2713培養(yǎng)時，不貼附與支持物上，而呈懸浮狀態(tài)生長。S180細胞（二體外培養(yǎng)細胞的生存空間和營養(yǎng)是有限的，當細胞增殖達到一定密度后，需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液。這一過程稱“傳代”。每次傳代都要影響細胞生長過程。另外，體外生存期一般也不是無限的。（一）組織培養(yǎng)細胞生命期（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程（三）細胞周期三、組織培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程2022/11/2714體外培養(yǎng)細胞的生存空間和營養(yǎng)是有限的，當細胞增殖培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。大多生存一年左右，傳30~50代，相當150~300個細胞周期，在全生存過程中大致經(jīng)歷以下三個階段：1、第I期-----原代培養(yǎng)期（初代培養(yǎng)期）從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，約1~4周。與體內(nèi)細胞性狀相似，適宜進行疫苗制備、藥物測試、移植等。為保持二倍體體細胞性質(zhì)，應(yīng)在初代或傳代后早期冰凍。（一）組織培養(yǎng)細胞生命期2022/11/2715培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體2、第II期----傳代期初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后，便稱做“細胞系”。此期，是生命期中持續(xù)時間最長、細胞增殖旺盛，呈二倍體核型的細胞系稱“二倍體細胞系”3、第III期-----衰退期細胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退死亡。在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在不明原因的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。標志之一，是細胞獲得不死性即持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱“無限細胞系”。主要發(fā)生在II期，核型大多變成異倍體，轉(zhuǎn)化后的細胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性而無惡性。（一）組織培養(yǎng)細胞生命期2022/11/27162、第II期----傳代期（一）組織培養(yǎng)細胞生命期2022初代培養(yǎng)有限細胞系

無限細胞系接種培養(yǎng)第一次傳代傳代傳代間隔老化死亡轉(zhuǎn)化指數(shù)細胞數(shù)量02468101216周22201816141210862022/11/2717初代培養(yǎng)有限細胞系所有體外培養(yǎng)細胞，包括初代培養(yǎng)及各種細胞系，當生長達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與接種數(shù)量、細胞生物學性狀以及營養(yǎng)液的性質(zhì)等有關(guān)。細胞的“一代”僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間。如：某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代或倍增不同。在細胞一代中，細胞能倍增3~6次（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/2718所有體外培養(yǎng)細胞，包括初代培養(yǎng)及各種細胞系，當生長達到一細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下幾個階段：1、游離期（懸浮期）2、貼壁期3、潛伏期4、指數(shù)生長期5、停止期（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程來源：人體腎臟

形態(tài)：上皮細胞

生長特性：貼壁

注釋：該細胞含腺病毒5DNA

2022/11/2719細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下幾個階段：（二）組織培養(yǎng)細胞一代1、游離期（懸浮期）細胞接種后，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的階段，細胞胞質(zhì)回縮，胞體變成圓形。（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/27201、游離期（懸浮期）（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/2、貼壁期：細胞附著于支持物上。原代細胞：24h內(nèi)貼壁。連續(xù)細胞系：5~30分鐘貼壁。單個細胞快于細胞團、組織塊。貼壁與許多因素有關(guān)：培養(yǎng)基的酸度、污染，膠塞和培養(yǎng)器皿的清潔度，細胞本身的活性等等。血清中有許多促使細胞貼壁的冷析球蛋白（CIG）和纖粘素（FN）CIG與多聚賴氨酸聯(lián)用，有利于細胞迅速貼壁。貼壁后細胞變成放射延展細胞→極性細胞再經(jīng)過一個潛伏期階段后，才進入生長期。細胞的貼壁和延展（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/27212、貼壁期：細胞的貼壁和延展（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程23、潛伏期：此時，細胞有生長活動，而無細胞分裂。原代細胞潛伏期：24~96h或更長。連續(xù)細胞系、腫瘤細胞潛伏期短：僅6~24h。

潛伏期后，細胞分裂出現(xiàn)，并逐漸增多，進入指數(shù)生長期。（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/27223、潛伏期：（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/24、指數(shù)生長期（對數(shù)生長期）此時期，細胞增殖旺盛，細胞數(shù)成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。此階段可用細胞群體倍增時間、細胞分裂指數(shù)（MI）等來判斷。MI：細胞群中每1000個細胞中的分裂細0.2~0.5%，連續(xù)細胞系、腫瘤細胞的MI可高達3~5%。持續(xù)3~5天，細胞數(shù)量增多，最后生長面積消失，細胞相互接觸連接成片。此時，細胞由于相互接觸而發(fā)生“接觸抑制”。表現(xiàn)為細胞擴展運動停止。保證細胞不重疊生長。腫瘤細胞無接觸抑制特征，能相互重疊，向三維空間發(fā)展，只要原因充分，細胞仍能分裂、增多。正常細胞生長匯合成單層時，細胞達到一定密度，細胞停止分裂，這種現(xiàn)象稱“密度抑制”。導(dǎo)致細胞停止分裂。（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/27234、指數(shù)生長期（對數(shù)生長期）（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程25、停止期：

數(shù)量已達飽和，停止增殖，但仍有代謝活動，營養(yǎng)枯竭，代謝產(chǎn)物積累，PH降低，細胞會中毒。通常，細胞長滿瓶底80%時即傳代，接種到2~3個新瓶中。（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/27245、停止期：（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/22022/11/27252022/11/2725是指細胞每一次增殖所經(jīng)歷的全過程。每經(jīng)過一個增殖周期，數(shù)量就增加一倍。據(jù)細胞周期不同時期的生化特點，可劃分為四個連續(xù)的時期：

G1期（DNA合成前期）細胞間期S期（DNA合成期）主要是DNA的復(fù)制。

G2期（DNA合成后期）

M期（有絲分裂期）：完成染色體的分配。細胞完成一次細胞周期所需要的時間稱為-----------“細胞周期時間”。（三）細胞周期2022/11/2726是指細胞每一次增殖所經(jīng)歷的全過程。（三）細胞周期2022/1

S期：DNA合成期間期：是細胞代謝、DNA復(fù)制旺盛時期。

G1、G2：兩個間隙有絲分裂：細胞核及其染色體分裂。細胞分裂期：胞質(zhì)分裂：細胞質(zhì)分裂成兩個子細胞。2022/11/2727

有絲分裂過程2022/11/2728有絲分裂過程2022/11/2728細胞生長的速度與細胞周期時間有關(guān)。正常細胞和腫瘤細胞相比較，細胞周期時間大致相接近的。如：人的正常腸上皮細胞的細胞周期時間是：1~3天。人的結(jié)腸癌細胞的細胞周期時間是：2.5天。

急性白細胞的細胞周期時間是2~4天。正常白細胞的細胞周期時間是1天。所不同的是：正常細胞的增殖達到一定限度就停止了，而且增殖的細胞基本上相當于丟失的細胞數(shù)，總數(shù)始終保持相對恒定。腫瘤細胞是以持續(xù)的無限制增殖、永不停止。一般說來，哺乳動物的細胞周期為10~30h，其中間期約10h。（三）細胞周期2022/11/2729細胞生長的速度與細胞周期時間有關(guān)。（三）細胞周期2022/1在體外培養(yǎng)中，單個細胞也能生存和生長，有很大的獨立性，但不是細胞永久存在的形式，不能長期生存，只有群體細胞才是細胞的基本存在形式。體外培養(yǎng)細胞間仍具有形態(tài)和功能的相互依存關(guān)系，細胞上仍有橋粒、縫隙連接，一旦兩相鄰細胞發(fā)生接觸，便呈接觸抑制現(xiàn)象，導(dǎo)致運動停止。四、細胞相互關(guān)系2022/11/2730在體外培養(yǎng)中，單個細胞也能生存和生長，有很大的獨立性，無污染環(huán)境溫度氣體環(huán)境和氫離子濃度基本營養(yǎng)物質(zhì)促生長因子、激素滲透壓五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2731無污染環(huán)境五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2731（一）無污染環(huán)境

無菌、無毒是保證細胞生存的首要條件。（二）溫度：35~370C39~400C中1h，有一定損傷，但仍可以恢復(fù)。41~420C中1h，細胞嚴重損傷，但不致全部殺死，仍有可能恢復(fù)。430C時，很多細胞被殺死。溫度>00C：能抑制細胞代謝，并無傷害作用。

40C數(shù)小時→370C培養(yǎng)，細胞仍能生長。

溫度降至冰點以下，細胞可因胞質(zhì)結(jié)冰而死亡。

在培養(yǎng)液中加一定量保護劑（二甲基亞砜或甘油），封入安瓿中后，凍于液氮中，-1960C，能長期貯存，解凍后細胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長，細胞的生物性狀不受任何影響，此為細胞保存的主要手段。五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2732（一）無污染環(huán)境五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/273（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度所需氣體主要有O2，CO2。1、O2：參與三羧酸循環(huán)，供能。缺O(jiān)2，多數(shù)不能生長。一般，95%空氣加5%CO2混合氣體。O2分壓太高，對細胞也有毒害作用。2、CO2：既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，與維持培養(yǎng)液的PH有直接關(guān)系。大多數(shù)細胞PH7.2~7.4，但各種細胞對PH的要求也不完全相同。原代細胞一般對PH變動耐受性差，無限細胞系耐受性強。總的來說，細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸中更有利于生長。如：原代羊水細胞，PH6.8時最適。五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2733（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/1細胞在生長過程中，不斷釋放CO2，培養(yǎng)液變酸，為維持培養(yǎng)液中PH的恒定，最常用的方法是加磷酸鹽緩沖劑

其中，NaHCO3CO2能調(diào)節(jié)CO2的含量。NaHCO3+H2O→Na+HCO3-+H2O→Na++H2CO3+OH-→Na++OH-+H2O+CO2↑。CO2易于逸出，只適用于封閉式培養(yǎng)。開瓶培養(yǎng)時，需在5%CO2

氣體環(huán)境中（CO2

培養(yǎng)箱）。為克服NaHCO3的缺點，也可用Hepes（羥乙基派嗪乙硫磺酸）它對細胞無毒性，是具有較強緩沖能力的氫離子緩沖劑。主要能穩(wěn)定和抵抗快速PH變化。其最大優(yōu)點：開瓶通氣觀察也能維持PH值。五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2734細胞在生長過程中，不斷釋放CO2，培養(yǎng)液變酸，為維持培養(yǎng)液中（四）基本營養(yǎng)物質(zhì)1、糖：葡萄糖、核糖、丙酮酸。2、12種基本氨基酸：精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸、纈氨酸。谷氨酰胺：作為氮源、碳源，能促進各種氨基酸進入細胞。3、維生素：VitA、D、E、K、B族、C。4、無機鹽：Fe++、Zn++、Cu++。五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2735（四）基本營養(yǎng)物質(zhì)五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/27（五）促生長因子、激素如：胰島素-------促進葡萄糖、氨基酸的吸收。氫化可的松--------細胞粘著，增殖。（六）滲透壓7.6個大氣壓（5776mmHg）=770KPa。五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2736（五）促生長因子、激素五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/

半固體培養(yǎng)基按物理性狀：

液體培養(yǎng)基--------最主要的。按來源分：

天然培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基+血漿、血清、胎汁。

合成培養(yǎng)基：據(jù)細胞所需的嚴格配制。無血清培養(yǎng)基：增添促細胞生長因子。六、人工培養(yǎng)基2022/11/2737半固體培養(yǎng)基六、人工培養(yǎng)基202除少數(shù)懸浮型細胞外，絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細胞需附著在適宜的底物上才能生長。細胞貼附底物生長的性質(zhì)稱“錨著依賴性”。原則上講，凡對細胞無毒性的物質(zhì)，都可用作底物。但不同的細胞對底物的要求各異，底物不合適，細胞生長不良。玻璃一次性塑料微載體飼細胞（也稱滋養(yǎng)細胞）七、附著底物2022/11/2738除少數(shù)懸浮型細胞外，絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細胞需附著在適宜的底（一）玻璃是最常用的培養(yǎng)底物，透明、便于觀察、洗滌，能反復(fù)使用，質(zhì)地以中性玻璃為上，適合于各種細胞附著生長。缺點：易破碎。（二）一次性塑料聚苯乙烯。經(jīng)加工處理，表面具有親水性，聚四氟乙烯。七、附著底物2022/11/2739（一）玻璃七、附著底物2022/11/2739（三）微載體由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球體，附著面大，有利于大量繁殖細胞。天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）作載體，直徑50um或數(shù)百um不等，如：微載體培養(yǎng)系統(tǒng)。（四）飼細胞（也稱滋養(yǎng)細胞）可用小鼠成纖維細胞或其它細胞長成單層后，再用大劑量射線照射，使細胞失去增殖力，但還存活，仍能進行代謝活動，可支持其它細胞生長。七、附著底物2022/11/2740（三）微載體七、附著底物2022/11/2740（一）常用術(shù)語1、細胞培養(yǎng)：單個細胞在體外條件下的生長。2、組織或器官培養(yǎng)：是指組織、器官在體外的維持或生長，它們可以分化并保持原來的結(jié)構(gòu)或功能。3、外植塊：用于開始體外培養(yǎng)而切下的一小塊組織或器官。4、細胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細胞系。

如果細胞系不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限------有限細胞系。如果細胞系可連續(xù)傳代-----連續(xù)細胞系，即已建成的細胞系。八、細胞系（株）的建立2022/11/2741（一）常用術(shù)語八、細胞系（株）的建立2022/11/27415、細胞一代時間：單個細胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。6、再培養(yǎng)：單層細胞不經(jīng)任何丟失而轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基的過程。7、原代培養(yǎng)：從機體取得材料（細胞、組織或器官）在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)到第一次傳代前，即為原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)。8、傳代培養(yǎng)或傳代：指將細胞從一個培養(yǎng)容器移植到另一培養(yǎng)容器中培養(yǎng)。八、細胞系（株）的建立2022/11/27425、細胞一代時間：單個細胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。八、細胞系（二）建立細胞系（株）的要求限于初代培養(yǎng)的細胞，只要供體均一，取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定，則無須多項鑒定。長期使用，特別是反復(fù)傳代的細胞，有以下一些要求：1、組織來源2、細胞生物學檢測3、培養(yǎng)條件和方法八、細胞系（株）的建立2022/11/2743（二）建立細胞系（株）的要求八、細胞系（株）的建立2022/1、組織來源：所屬物種（人或動物）、性別、年齡、所取的器官組織等。如系腫瘤組織，應(yīng)說明臨床和病理診斷、以及病理號。2、細胞生物學檢測：如：細胞的一般形態(tài)、特異結(jié)構(gòu)、細胞生長曲線、分裂指數(shù)、倍增指數(shù)、接種率等。如為腫瘤細胞，應(yīng)力求說明細胞確系來源于腫瘤組織。3、培養(yǎng)條件和方法：指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及細胞生存的適宜PH值。八、細胞系（株）的建立2022/11/27441、組織來源：八、細胞系（株）的建立2022/11/2744再見2022/11/2745再見2022/11/2745組織培養(yǎng)細胞的生物學第二章組織培養(yǎng)細胞的生物學第二章Contents細胞生存環(huán)境和代謝附著底物人工培養(yǎng)基教學內(nèi)容1235體內(nèi)、外細胞的差異和分化體外培養(yǎng)細胞的分型細胞相互關(guān)系細胞系（株）的建立87643組織培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程2022/11/2747Contents細胞生存環(huán)境和代謝附著底物人工培養(yǎng)基教學內(nèi)容在個體發(fā)生過程中，細胞通過不斷的生長和繁殖，數(shù)量增多，與此同時發(fā)生著分化。分化：及細胞在形態(tài)和功能上由一般發(fā)展到特殊的過程，由于分化的結(jié)果，形成了各種組織和器官。一、體內(nèi)、外細胞的差異和分化2022/11/2748在個體發(fā)生過程中，細胞通過不斷的生長和繁殖，數(shù)量增多，因模擬的培養(yǎng)條件與體內(nèi)實際情況仍有很大差異，易發(fā)生以下變化：分化現(xiàn)象減少，形態(tài)和功能趨于單一，生存一定時間后衰退死亡或發(fā)生轉(zhuǎn)化，變成有無限生長能力的連續(xù)細胞系或惡性細胞系。如：腺細胞分泌機能喪失，肌細胞纖維細胞化。原因：細胞在人工培養(yǎng)以后，可能導(dǎo)致很多基因關(guān)閉，而導(dǎo)致分化停止、功能喪失?？梢岳眠@一點，來研究基因表達和調(diào)控。（一）差異2022/11/2749因模擬的培養(yǎng)條件與體內(nèi)實際情況仍有很大差異，易發(fā)生以下變化：體外培養(yǎng)細胞分化能力并未完全喪失，只是因環(huán)境改變其分化表現(xiàn)和原體內(nèi)不同。如：體內(nèi)：成纖維細胞、骨細胞→膠原體外：成纖維細胞、上皮細胞、神經(jīng)細胞、腫瘤細胞→膠原。如何揭示細胞分化的條件，闡明分化調(diào)控的機制是主要的。（二）分化2022/11/2750體外培養(yǎng)細胞分化能力并未完全喪失，只是因環(huán)境改變其分化表現(xiàn)和據(jù)能否貼附在支持物上生長的性質(zhì)，分：2、懸浮型(ES細胞，老鼠，初生培養(yǎng)；熒光，DAPI染色劑)1、貼附型(心肌細胞，老鼠，初生培養(yǎng))二、體外培養(yǎng)細胞的分型2022/11/2751據(jù)能否貼附在支持物上生長的性質(zhì)，分：2、懸浮型(ES細胞，老培養(yǎng)時能貼附在支持物上生長，大多數(shù)細胞呈貼附型生長。特點：1、分化現(xiàn)象變得不顯著，易失去它們在體內(nèi)時的原有特征。2、形態(tài)上常表現(xiàn)單一化的現(xiàn)象，并常反映其胚層起源，類似所謂“返祖”現(xiàn)象。如：起源于內(nèi)、外胚層的細胞多呈上皮型。

中胚層------------------呈成纖維細胞型。體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)常表現(xiàn)有一般化的傾向。因此，判定細胞形態(tài)很難按體內(nèi)細胞標準確定，僅大致分成以下幾類：（一）貼附型2022/11/2752培養(yǎng)時能貼附在支持物上生長，大多數(shù)細胞呈貼附型生長。（一）貼與體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)相似而得名。心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮（中胚層間充質(zhì)起源）都呈此形態(tài)。成纖維細胞型1、成纖維細胞型2022/11/2753與體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)相似而得名。心肌、平滑肌、成骨細

起源于內(nèi)、外胚層細胞。如：皮膚表皮，消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等。

上皮細胞型2、上皮細胞型2022/11/2754起源于內(nèi)、外胚層細胞。上皮細胞型2、上皮細胞型2022/此型不穩(wěn)定，有時難與其它細胞相區(qū)別。游走細胞型3、游走細胞型2022/11/2755此型不穩(wěn)定，有時難與其它細胞相區(qū)別。游走細胞型3、游走細胞型除上述三型外，其它難以確定它們規(guī)律和形態(tài)的，統(tǒng)歸為“多形細胞型”。如：神經(jīng)組織的細胞。多型細胞型4、多形細胞型2022/11/2756除上述三型外，其它難以確定它們規(guī)律和形態(tài)的，統(tǒng)歸為“多形細培養(yǎng)細胞的形態(tài)受多種因素的影響，如：溫度，二氧化碳，酸、堿、密度等。如：Hela細胞，本屬上皮型，但過酸、過堿變成梭形。上皮細胞數(shù)量少時，呈星形或三角形。數(shù)量多時，呈上皮型。它來源于美國的HelenLane，她1951年死于子宮頸癌2022/11/2757培養(yǎng)細胞的形態(tài)受多種因素的影響，它來源于美國的Hele培養(yǎng)時，不貼附與支持物上，而呈懸浮狀態(tài)生長。如：某些癌細胞、白細胞。其優(yōu)點：細胞生存空間大，容許長時間生長，能繁殖多量細胞，便于做細胞代謝研究。S180細胞（二）懸浮型2022/11/2758培養(yǎng)時，不貼附與支持物上，而呈懸浮狀態(tài)生長。S180細胞（二體外培養(yǎng)細胞的生存空間和營養(yǎng)是有限的，當細胞增殖達到一定密度后，需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液。這一過程稱“傳代”。每次傳代都要影響細胞生長過程。另外，體外生存期一般也不是無限的。（一）組織培養(yǎng)細胞生命期（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程（三）細胞周期三、組織培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程2022/11/2759體外培養(yǎng)細胞的生存空間和營養(yǎng)是有限的，當細胞增殖培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。大多生存一年左右，傳30~50代，相當150~300個細胞周期，在全生存過程中大致經(jīng)歷以下三個階段：1、第I期-----原代培養(yǎng)期（初代培養(yǎng)期）從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，約1~4周。與體內(nèi)細胞性狀相似，適宜進行疫苗制備、藥物測試、移植等。為保持二倍體體細胞性質(zhì)，應(yīng)在初代或傳代后早期冰凍。（一）組織培養(yǎng)細胞生命期2022/11/2760培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體2、第II期----傳代期初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后，便稱做“細胞系”。此期，是生命期中持續(xù)時間最長、細胞增殖旺盛，呈二倍體核型的細胞系稱“二倍體細胞系”3、第III期-----衰退期細胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退死亡。在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在不明原因的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。標志之一，是細胞獲得不死性即持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱“無限細胞系”。主要發(fā)生在II期，核型大多變成異倍體，轉(zhuǎn)化后的細胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性而無惡性。（一）組織培養(yǎng)細胞生命期2022/11/27612、第II期----傳代期（一）組織培養(yǎng)細胞生命期2022初代培養(yǎng)有限細胞系

無限細胞系接種培養(yǎng)第一次傳代傳代傳代間隔老化死亡轉(zhuǎn)化指數(shù)細胞數(shù)量02468101216周22201816141210862022/11/2762初代培養(yǎng)有限細胞系所有體外培養(yǎng)細胞，包括初代培養(yǎng)及各種細胞系，當生長達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與接種數(shù)量、細胞生物學性狀以及營養(yǎng)液的性質(zhì)等有關(guān)。細胞的“一代”僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間。如：某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代或倍增不同。在細胞一代中，細胞能倍增3~6次（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/2763所有體外培養(yǎng)細胞，包括初代培養(yǎng)及各種細胞系，當生長達到一細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下幾個階段：1、游離期（懸浮期）2、貼壁期3、潛伏期4、指數(shù)生長期5、停止期（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程來源：人體腎臟

形態(tài)：上皮細胞

生長特性：貼壁

注釋：該細胞含腺病毒5DNA

2022/11/2764細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下幾個階段：（二）組織培養(yǎng)細胞一代1、游離期（懸浮期）細胞接種后，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的階段，細胞胞質(zhì)回縮，胞體變成圓形。（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/27651、游離期（懸浮期）（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/2、貼壁期：細胞附著于支持物上。原代細胞：24h內(nèi)貼壁。連續(xù)細胞系：5~30分鐘貼壁。單個細胞快于細胞團、組織塊。貼壁與許多因素有關(guān)：培養(yǎng)基的酸度、污染，膠塞和培養(yǎng)器皿的清潔度，細胞本身的活性等等。血清中有許多促使細胞貼壁的冷析球蛋白（CIG）和纖粘素（FN）CIG與多聚賴氨酸聯(lián)用，有利于細胞迅速貼壁。貼壁后細胞變成放射延展細胞→極性細胞再經(jīng)過一個潛伏期階段后，才進入生長期。細胞的貼壁和延展（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/27662、貼壁期：細胞的貼壁和延展（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程23、潛伏期：此時，細胞有生長活動，而無細胞分裂。原代細胞潛伏期：24~96h或更長。連續(xù)細胞系、腫瘤細胞潛伏期短：僅6~24h。

潛伏期后，細胞分裂出現(xiàn)，并逐漸增多，進入指數(shù)生長期。（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/27673、潛伏期：（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/24、指數(shù)生長期（對數(shù)生長期）此時期，細胞增殖旺盛，細胞數(shù)成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。此階段可用細胞群體倍增時間、細胞分裂指數(shù)（MI）等來判斷。MI：細胞群中每1000個細胞中的分裂細0.2~0.5%，連續(xù)細胞系、腫瘤細胞的MI可高達3~5%。持續(xù)3~5天，細胞數(shù)量增多，最后生長面積消失，細胞相互接觸連接成片。此時，細胞由于相互接觸而發(fā)生“接觸抑制”。表現(xiàn)為細胞擴展運動停止。保證細胞不重疊生長。腫瘤細胞無接觸抑制特征，能相互重疊，向三維空間發(fā)展，只要原因充分，細胞仍能分裂、增多。正常細胞生長匯合成單層時，細胞達到一定密度，細胞停止分裂，這種現(xiàn)象稱“密度抑制”。導(dǎo)致細胞停止分裂。（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/27684、指數(shù)生長期（對數(shù)生長期）（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程25、停止期：

數(shù)量已達飽和，停止增殖，但仍有代謝活動，營養(yǎng)枯竭，代謝產(chǎn)物積累，PH降低，細胞會中毒。通常，細胞長滿瓶底80%時即傳代，接種到2~3個新瓶中。（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/27695、停止期：（二）組織培養(yǎng)細胞一代生長過程2022/11/22022/11/27702022/11/2725是指細胞每一次增殖所經(jīng)歷的全過程。每經(jīng)過一個增殖周期，數(shù)量就增加一倍。據(jù)細胞周期不同時期的生化特點，可劃分為四個連續(xù)的時期：

G1期（DNA合成前期）細胞間期S期（DNA合成期）主要是DNA的復(fù)制。

G2期（DNA合成后期）

M期（有絲分裂期）：完成染色體的分配。細胞完成一次細胞周期所需要的時間稱為-----------“細胞周期時間”。（三）細胞周期2022/11/2771是指細胞每一次增殖所經(jīng)歷的全過程。（三）細胞周期2022/1

S期：DNA合成期間期：是細胞代謝、DNA復(fù)制旺盛時期。

G1、G2：兩個間隙有絲分裂：細胞核及其染色體分裂。細胞分裂期：胞質(zhì)分裂：細胞質(zhì)分裂成兩個子細胞。2022/11/2772

有絲分裂過程2022/11/2773有絲分裂過程2022/11/2728細胞生長的速度與細胞周期時間有關(guān)。正常細胞和腫瘤細胞相比較，細胞周期時間大致相接近的。如：人的正常腸上皮細胞的細胞周期時間是：1~3天。人的結(jié)腸癌細胞的細胞周期時間是：2.5天。

急性白細胞的細胞周期時間是2~4天。正常白細胞的細胞周期時間是1天。所不同的是：正常細胞的增殖達到一定限度就停止了，而且增殖的細胞基本上相當于丟失的細胞數(shù)，總數(shù)始終保持相對恒定。腫瘤細胞是以持續(xù)的無限制增殖、永不停止。一般說來，哺乳動物的細胞周期為10~30h，其中間期約10h。（三）細胞周期2022/11/2774細胞生長的速度與細胞周期時間有關(guān)。（三）細胞周期2022/1在體外培養(yǎng)中，單個細胞也能生存和生長，有很大的獨立性，但不是細胞永久存在的形式，不能長期生存，只有群體細胞才是細胞的基本存在形式。體外培養(yǎng)細胞間仍具有形態(tài)和功能的相互依存關(guān)系，細胞上仍有橋粒、縫隙連接，一旦兩相鄰細胞發(fā)生接觸，便呈接觸抑制現(xiàn)象，導(dǎo)致運動停止。四、細胞相互關(guān)系2022/11/2775在體外培養(yǎng)中，單個細胞也能生存和生長，有很大的獨立性，無污染環(huán)境溫度氣體環(huán)境和氫離子濃度基本營養(yǎng)物質(zhì)促生長因子、激素滲透壓五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2776無污染環(huán)境五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2731（一）無污染環(huán)境

無菌、無毒是保證細胞生存的首要條件。（二）溫度：35~370C39~400C中1h，有一定損傷，但仍可以恢復(fù)。41~420C中1h，細胞嚴重損傷，但不致全部殺死，仍有可能恢復(fù)。430C時，很多細胞被殺死。溫度>00C：能抑制細胞代謝，并無傷害作用。

40C數(shù)小時→370C培養(yǎng)，細胞仍能生長。

溫度降至冰點以下，細胞可因胞質(zhì)結(jié)冰而死亡。

在培養(yǎng)液中加一定量保護劑（二甲基亞砜或甘油），封入安瓿中后，凍于液氮中，-1960C，能長期貯存，解凍后細胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長，細胞的生物性狀不受任何影響，此為細胞保存的主要手段。五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2777（一）無污染環(huán)境五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/273（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度所需氣體主要有O2，CO2。1、O2：參與三羧酸循環(huán)，供能。缺O(jiān)2，多數(shù)不能生長。一般，95%空氣加5%CO2混合氣體。O2分壓太高，對細胞也有毒害作用。2、CO2：既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，與維持培養(yǎng)液的PH有直接關(guān)系。大多數(shù)細胞PH7.2~7.4，但各種細胞對PH的要求也不完全相同。原代細胞一般對PH變動耐受性差，無限細胞系耐受性強。總的來說，細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸中更有利于生長。如：原代羊水細胞，PH6.8時最適。五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2778（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/1細胞在生長過程中，不斷釋放CO2，培養(yǎng)液變酸，為維持培養(yǎng)液中PH的恒定，最常用的方法是加磷酸鹽緩沖劑

其中，NaHCO3CO2能調(diào)節(jié)CO2的含量。NaHCO3+H2O→Na+HCO3-+H2O→Na++H2CO3+OH-→Na++OH-+H2O+CO2↑。CO2易于逸出，只適用于封閉式培養(yǎng)。開瓶培養(yǎng)時，需在5%CO2

氣體環(huán)境中（CO2

培養(yǎng)箱）。為克服NaHCO3的缺點，也可用Hepes（羥乙基派嗪乙硫磺酸）它對細胞無毒性，是具有較強緩沖能力的氫離子緩沖劑。主要能穩(wěn)定和抵抗快速PH變化。其最大優(yōu)點：開瓶通氣觀察也能維持PH值。五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2779細胞在生長過程中，不斷釋放CO2，培養(yǎng)液變酸，為維持培養(yǎng)液中（四）基本營養(yǎng)物質(zhì)1、糖：葡萄糖、核糖、丙酮酸。2、12種基本氨基酸：精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸、纈氨酸。谷氨酰胺：作為氮源、碳源，能促進各種氨基酸進入細胞。3、維生素：VitA、D、E、K、B族、C。4、無機鹽：Fe++、Zn++、Cu++。五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2780（四）基本營養(yǎng)物質(zhì)五、細胞生存環(huán)境和代謝2022/11/27（五）促生長因子、激素如：胰島素-------促進葡萄糖、氨基酸的吸收。氫