植物組織培養(yǎng)基礎(chǔ)知識

植物學(xué)及植物生理學(xué)教研室王連翠第1頁，共28頁。AGlimpseofPlantTissueCulture第2頁，共28頁。第一章緒論第二章基本技術(shù)與設(shè)施第三章培養(yǎng)基第四章愈傷組織第五章器官培養(yǎng)第六章植物脫毒技術(shù)第七章細胞培養(yǎng)與原生質(zhì)體培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)第3頁，共28頁。本課程學(xué)習目標掌握基本原理掌握基本概念了解開展組織培養(yǎng)工作的基本設(shè)施掌握植物組織培養(yǎng)基本的操作技術(shù)掌握植物組織培養(yǎng)在植物快繁脫毒等方面的應(yīng)用第4頁，共28頁。概念類型形成與發(fā)展應(yīng)用原理

第一章植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識第5頁，共28頁。植物組織培養(yǎng)（Planttissueculture）：指在無菌和在人工控制下，將離體植物的器官、組織、細胞以及原生質(zhì)體培養(yǎng)在人工配制的無菌培養(yǎng)基上，在適宜的培養(yǎng)條件（營養(yǎng)、光照、溫度）下，使其繼續(xù)分裂、分化和發(fā)育的技術(shù)。植物離體培養(yǎng)（Plantinvitroculture）試管培養(yǎng)（Intest-tubeculture）一、植物組織培養(yǎng)的概念第6頁，共28頁。第7頁，共28頁。二、組織培養(yǎng)的原理1．細胞全能性學(xué)說植物體的每一個細胞都攜帶有一套完整的基因組，并具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力。全能性只是一種可能性。要把這種可能性變?yōu)楝F(xiàn)實性必須滿足兩個條件：一：離體的條件下。二：要給予它們適當?shù)拇碳?，即給予它們一定的營養(yǎng)物質(zhì)，并使它們受到一定的激素的作用。全能性體現(xiàn)的兩個過程脫分化過程再分化過程。再分化的過程有兩種方式：

器官發(fā)生方式胚胎發(fā)生方式第8頁，共28頁。2.激素（植物生長調(diào)節(jié)劑）調(diào)控（1）生長素用于誘導(dǎo)愈傷組織的形成，體細胞胚的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細胞分裂素誘導(dǎo)腋芽和不定芽的產(chǎn)生。常用的生長素:2,4—二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚丁酸（IBA）等。作用強弱順序:2，4-D＞NAA＞IBA＞IAA。(2)細胞分裂素促進細胞分裂與分化，延遲組織衰老，增強蛋白質(zhì)合成，促進側(cè)芽生長及顯著改變其他激素作用的特點。常見的細胞分裂素有：2—異戊烯腺嘌呤（2-iP）、玉米素（ZT）、6—芐基氨基腺嘌呤（6-BA）、激動素（KT）、苯基噻二唑基脲（TDZ）。作用強弱順序:TDZ＞2—ip＞ZT＞6—BA＞KT。(3)赤霉素在植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用的僅有GA3一種，它是一種天然產(chǎn)物，能促進已分化芽的伸長生長。其他植物生長調(diào)節(jié)劑:如脫落酸（ABA）、乙烯利（CEDP）等在植物組織培養(yǎng)中也有一定的應(yīng)用。注：生長素/細胞分裂素的比值:大時有利于根的形成，這時生長素起主導(dǎo)作用；比值小時，則促進芽的形成，這時細胞分裂素起主導(dǎo)作用。

第9頁，共28頁。外植體愈傷組織器官或胚胎完整植株脫分化再分化脫分化再分化圖式第10頁，共28頁。三、組織培養(yǎng)的類型植物培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)器官培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)細胞培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)培養(yǎng)材料培養(yǎng)方式固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)靜置培養(yǎng)紙橋培養(yǎng)第11頁，共28頁。第12頁，共28頁。將外植體接種在培養(yǎng)基上，由于植物生長調(diào)節(jié)劑的存在，其細胞脫分化形成愈傷組織，然后通過再分化形成再生植株。愈傷組織是一種最常見的培養(yǎng)形式，因為除莖尖分生組織和一部分器官以外，其他的幾種培養(yǎng)形式最終也都要經(jīng)過愈傷組織才能再生植株。愈傷組織的形態(tài)發(fā)生途徑:①胚胎發(fā)生途徑②器官發(fā)生途徑

(1)愈傷組織培養(yǎng)第13頁，共28頁。

器官培養(yǎng)是通過培養(yǎng)器官的類別來分類的。培養(yǎng)的是什么器官，就稱為什么培養(yǎng)。如根、莖、葉、花、果實、種子的培養(yǎng)。

(2)器官培養(yǎng)第14頁，共28頁。胚培養(yǎng)是器官培養(yǎng)的一種。選用的外植體是成熟或未成熟的胚進行離體無菌培養(yǎng)。其具體方法是將取出放在液體或固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，由于胚包含在胚珠和子房里，因而進行胚胎培養(yǎng)時，常常是將胚珠和子房放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。胚培養(yǎng)用途：1.拯救胚。2.研究胚的發(fā)育營養(yǎng)研究。3.一些特殊的領(lǐng)域的研究。(3)胚培養(yǎng)第15頁，共28頁。英國批準在實驗室培養(yǎng)人和動物混合胚胎用于研究

第16頁，共28頁。

細胞培養(yǎng)：將植物的單個細胞或細胞團分離出來，放在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

原生質(zhì)體培養(yǎng)：指將植物細胞的細胞壁通過物理或化學(xué)的方法去除，然后再進行培養(yǎng)。原生質(zhì)體培養(yǎng)的最大用處是體細胞雜交。Atropabelladonna（顛茄）(4)細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)70年代以后有關(guān)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交的研究得到了很訣發(fā)展，如煙草、曼陀羅、顛茄、胡蘿卜、油菜等能從其原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)再生分化長成胚或完整的植物，利用原生質(zhì)體融合已經(jīng)能使煙草屬和矮牽牛屬的雜種細胞增殖分化成雜種植株。第17頁，共28頁。Atropabelladonna（顛茄）第18頁，共28頁。四、組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史組織培養(yǎng)的發(fā)展過程大致可以分為三個階段：

萌芽階段（從20世紀初至20世紀30年代中）

奠基階段（從20世紀30年代末到20世紀50年代中）

快速發(fā)展階段和應(yīng)用階段（從20世紀50年代到現(xiàn)代）第19頁，共28頁。在Schleiden和Schwann所提出的細胞學(xué)說的推動下，德國植物生理學(xué)家Haberlandt于1902年提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割,直至分到單個細胞觀點和細胞全能性觀點。

1904年Hannig在無機鹽和蔗糖溶液中培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，并使這些胚在離體條件下長到成熟。后來，Laibach（1925，1929）把由亞麻種間雜交形成的不能成活的種子胚剝出，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)至成熟，從而證明了胚培養(yǎng)在植物遠緣雜交中利用的可能性；

1922年，美國的Robbins和德國的Kotte分別報道培養(yǎng)離體根尖獲得某些成功，這是有關(guān)根培養(yǎng)的最早的實驗。萌芽階段（從20世紀初至20世紀30年代中）第20頁，共28頁。Schleiden,MatthiasJakob(1804-1881)TheodorSchwann,Theodor(1810-1882),細胞學(xué)說第21頁，共28頁。奠基階段（從20世紀30年代中至20世紀50年代末）30年代中期，植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域兩個重要的發(fā)現(xiàn)，其一是認識了B族維生素對植物生長的重要意義；二是發(fā)現(xiàn)了生長素--一種天然的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。1934年，White由番茄根建立了第一個活躍生長的無性系，使根的離體培養(yǎng)實驗首次獲得了真正的成功。起初，他在實驗中使用的培養(yǎng)基包含無機鹽、酵母浸出液和蔗糖。后來（1937），他用3種B族維生素，即吡哆醇、硫胺素和煙酸，取代酵母浸出液獲得成功。此合成培養(yǎng)基后被稱為White培養(yǎng)基。Gautheret（1934）在山毛柳和黑楊等形成層組織的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，雖然在含有葡萄糖和鹽酸半胱氨酸的Knop溶液中，這些組織也可以不斷增殖幾個月，但只有在培養(yǎng)基中加入了B族維生素和IAA以后，山毛柳形成層組織的生長才能顯著增加。這些實驗揭示了B族維生素和生長素的重要意義，又直接導(dǎo)致了1939年Gautheret連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成獲得首次成功。同年，white由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜也建立了類似的連續(xù)生長的組織培養(yǎng)物。Gautheret，White和Nobecourt一起被譽為植物組織培養(yǎng)的奠基人。

40年代和50年代初期，活躍在植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域里的研究者以Skoog為代表，研究的主要內(nèi)容是利用嘌呤類物質(zhì)處理煙草髓愈傷組織以控制組織的生長和芽的形成Skoog（1944）和崔徵等（1951）發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷不但可以促進愈傷組織的生長，而且還能解除培養(yǎng)基中生長素（IAA）對芽形成的抑制作用，誘導(dǎo)芽的形成，從而確定了腺嘌呤與生長素的比例控制芽和根形成的主要條件之一。這些實驗結(jié)果導(dǎo)致了激動素和以后利用激動素和生長素在組織培養(yǎng)中控制器官分化工作開展。

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50年代開始以后的10年中，引人注目的植物組織培養(yǎng)的研究進展有以下6項：①1952年，Morel和Martin首次證實，通過莖尖分生組織離體培養(yǎng)，可以由已受病毒侵染的大麗花中獲得無毒植株。

②1953～1954年，Muir進行單細胞培養(yǎng)獲得初步成功。并對分離的單細胞進行了“看護培養(yǎng)”。實現(xiàn)Haberlandt培養(yǎng)單細胞可能性的這一設(shè)想。③1955年，Miller等由鯡魚精子DNA中分離出細胞分裂素，并把它定名為激動素（kinetin）。具有和激動素類似活性的合成的或天然的化合物已有多種，它們總稱為細胞分裂素（cytokinin）。應(yīng)用這類物質(zhì)，我們就有可能誘導(dǎo)已經(jīng)成熟和高度分化的組織（如葉肉和干種子胚乳）細胞進行分裂。④1957年，Skoog和Miller提出了有關(guān)植物激素控制器官形成的概念。

指出在煙草髓組織培養(yǎng)中，根和莖的分化是生長素對細胞分裂素比率的函數(shù)，通過改變培養(yǎng)基中這兩類生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的相對濃度可以控制器官的分化：這一比率高時促進生根，低時促進莖芽的分化。二者濃度相等時，組織則趨向于以一種無結(jié)構(gòu)的方式生長。后來證明，激素可調(diào)控器官發(fā)生的概念對于多數(shù)物種都可適用，只是由于在不同組織中這些激素的內(nèi)生水平不同，因而對于某一具體的形態(tài)發(fā)生過程來說，它們所要求的外源激素的水平也會有所不同。⑤1958年，Wickson和Thimann指出，應(yīng)用外源細胞分裂素可促成在頂芽存在的情況下處于休眠狀態(tài)的腋芽的生長。當把莖尖接種在含有細胞分裂素的培養(yǎng)基上以后，將可使側(cè)芽解除休眠狀態(tài)，而且，能夠從頂端優(yōu)勢下解脫出來的不只是那些既存于原來莖尖上的腋芽，此外，還有由原來的莖尖在培養(yǎng)中長成的側(cè)枝上的腋芽，結(jié)果就會形成一個郁郁蔥蔥的結(jié)構(gòu)，里面包含了數(shù)目很多的小枝條，其中每個小枝條又可取出來重復(fù)上述過程，于是在相當短的時間內(nèi)，就可以得到成千上萬的小枝條。當把這些小枝條轉(zhuǎn)夠到另外一種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根以后，即可移植于土壤中。⑥1958～1959年，Reinert和Steward分別報道，在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細胞胚。這是一種不同于通過芽和根的分化而形成植株的再生方式。現(xiàn)在知道有很多物種都能形成體細胞胚。在有些植物任何部分都可以得到體細胞胚，如胡蘿卜和毛茛上。第23頁，共28頁。（l）原生質(zhì)體培養(yǎng)取得重大突破

1960年Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功。1971年，Takebe等在煙草上首次。由原生質(zhì)體獲得了再生植株，這不但在理論上證明了除體細胞和生殖細胞以外，無壁的原生質(zhì)體同樣具有全能性，而且在實踐上可以為外源基因的導(dǎo)入提供理想的受體材料。1972年，Carlson等通過兩個煙草物種之間原生質(zhì)體的融合，獲得了第一個體細胞雜種，后來在有性親合及有性不親會的親本之間，不同作者又獲得了若干其他的體細胞雜種。（2）花藥培養(yǎng)取得顯著成績

1964年，Guha和Maheshwari報道，在南洋金花中通過離體花藥培養(yǎng)由小孢子直接發(fā)育成胚。1967年，Bourgin和Nitsch通過花藥培養(yǎng)獲得了完整的煙草植株。由于單倍體在突變選擇和加速雜合體純合化過程中的重要作用，這一領(lǐng)域的研究在整個70年代得到了迅速發(fā)展，獲得成功的物種數(shù)目增加到180余種，其中包括很多種重要的栽培植物。煙草、水稻和小麥等的花培育種在中國取得了引人注目的成就。

（3）微繁技術(shù)得到廣泛應(yīng)用

1960年，Morel提出了一個離體無性繁殖蘭花的方法。繁殖系數(shù)極高。由于這一方法有巨大的實用價值，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起“蘭花工業(yè)”。目前，用這種方法繁殖的蘭花至少已有35個屬150余種。除蘭花外，在其他很多觀賞植物和經(jīng)濟作物（如甘蔗和草莓等）中，快繁也已達到了工廠化消生產(chǎn)規(guī)模，在若干作物中與通過整尖培養(yǎng)進行脫毒相結(jié)合，產(chǎn)生了可觀的經(jīng)濟效益。

快速發(fā)展階段（從20世紀60年代至現(xiàn)在）第24頁，共28頁。挽救瀕臨滅絕的植物快速繁殖某些稀有植物或有較大經(jīng)濟價值的植物利用植物組織培養(yǎng)的材料作為植物生物反應(yīng)器植物組織培養(yǎng)結(jié)合超低溫保存技術(shù)經(jīng)濟有效地保存植物種質(zhì)資源用于遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、組織學(xué)、胚胎學(xué)、生物工程等的研究五、組織培養(yǎng)的應(yīng)用第25頁，共28頁。

1．什么是細胞全能性學(xué)說？如何理解?2．什么是植物組織培養(yǎng)?3．植物組織培養(yǎng)常用的激素哪些類