細(xì)胞凍存與蘇醒技術(shù)

細(xì)胞凍存與蘇醒技術(shù)IS概述細(xì)胞培育技術(shù)自1907年開創(chuàng)以來，歷經(jīng)一個(gè)世紀(jì)現(xiàn)已成為自然科學(xué)領(lǐng)域不可缺少的研究方式之一。在細(xì)胞培育技術(shù)普遍用于科學(xué)研究領(lǐng)域的令天，細(xì)胞株的冷凍保留和解凍蘇醒這一基礎(chǔ)技術(shù)日趨取得重視。低溫保留是活體組織保留最常常利用的方式之一。冷凍保留一般是指在0-196oC進(jìn)行保留，就是將體外培育物懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以必然的冷凍速度降至零下某一溫度，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保留的進(jìn)程。主要有-20~-40^冰箱保留、-60~-80oC深低溫冰箱和液氮（一196°C）超低溫保留等。應(yīng)用方向醫(yī)學(xué)方面最近幾年來干細(xì)胞的研究愈來愈被人們關(guān)注，由于它是一種具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在必然條件下，可分化為多種功能細(xì)胞。按照發(fā)育階段和取材來源，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞兩大類。骨髓和臍血是成體干細(xì)胞的主要來源。骨髓干細(xì)胞在骨髓中含量極少，約占骨髓有核細(xì)胞的十萬(wàn)分之一，所以要在臨床上普遍應(yīng)用首先必需具有先進(jìn)的凍存與蘇醒技術(shù)。而干細(xì)胞研究的深切將解決包括癌癥等一系列為人們所知的〃絕癥”。而〃冬眠”技術(shù)對(duì)醫(yī)學(xué)的發(fā)展有著里程碑式的意義。生物學(xué)方面細(xì)胞凍存技術(shù)是生物學(xué)保留物種的重要手腕。在環(huán)境受到前所未有的破壞動(dòng)物、植被隨時(shí)可能面臨滅絕危險(xiǎn)的今天，更是尤其關(guān)鍵，雖然不是治本的方式，但至少可以盡可能的留下那些曾經(jīng)存在的生命痕跡。發(fā)展歷史1776年.Spallanzani最先發(fā)表了“冷”處置對(duì)〃細(xì)胞”生命活動(dòng)影響的報(bào)導(dǎo)。十九世紀(jì)中后葉，許多初期的工作者(Prevost,1840;deQuatrefages,1853;Mantegazza,1866;Scheuk,1870)重復(fù)研究了低溫處置對(duì)精子活動(dòng)的影響，得出了和Spallanzani相似的結(jié)論。即〃冷不能殺死精子”。1900年前后科學(xué)家大體上肯定了生物成份能夠在零下溫度貯存的事實(shí)。二十世紀(jì)50年代Luyet等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)了電解質(zhì)濃度對(duì)貯存細(xì)胞的損傷作用，他們的大體結(jié)論是。電解質(zhì)濃度增大是造成貯存細(xì)胞損傷的主要原因。1972年.Mazur等首先按照中國(guó)倉(cāng)鼠組織培育細(xì)胞的低溫保留實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，提出關(guān)于冷凍損傷的兩因素假說目，即冰晶損傷和溶液損傷假說。這個(gè)假說以為隨著溫度的下降，細(xì)胞內(nèi)外的水分結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引發(fā)細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷即就是冰晶損傷(Intracellularicedamage)。冰晶損傷是由冷卻速度過快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。同時(shí)隨著溫度的下降.細(xì)胞外部的水分會(huì)先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高，細(xì)胞膜上的脂質(zhì)會(huì)因長(zhǎng)時(shí)問暴露在高溶質(zhì)的溶液中而受到損壞，細(xì)胞發(fā)生滲漏，致使在復(fù)溫時(shí)大量水分滲入細(xì)胞內(nèi)造成細(xì)胞死亡。這種因保留溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷被稱為溶液損傷(Solutiondamage)。溶液損傷是由冷卻速度過慢，使細(xì)胞在高濃度的溶液中暴露的時(shí)間太長(zhǎng)而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴(yán)重。凍存技術(shù)凍存技術(shù)液氮法目前，細(xì)胞凍存最常常利用的技術(shù)是液氮冷凍保留法，主要采用加適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法凍存細(xì)胞。細(xì)胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，且對(duì)細(xì)胞無明顯毒性。慢速冷凍方式又可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的機(jī)緣，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。常常利用的細(xì)胞冷凍貯存器為液氮貯存器，規(guī)格有35L3和50L3兩種。細(xì)胞凍存時(shí)常備的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%-20%的血清培育液，DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（121°C蒸氣高壓消毒），2mL安瓿（或?qū)Ｓ眉?xì)胞凍存管）、吸管、離心管、噴燈、紗布袋（或凍存管架）等。主要操作步驟為：（1）選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在凍存前一天最好換液。將多個(gè)培育瓶中的細(xì)胞培育液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培育液。用吸管吸取培育液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。懸浮生產(chǎn)細(xì)胞則不要消化處置。然后將細(xì)胞搜集于離心管中離心（1000r/min,10分鐘）。（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培育基，于4C預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，細(xì)胞濃度為3x106~1x107/mL之間。（3）將上述細(xì)胞分裝于安瓿或?qū)Ｓ美鋬鏊芰瞎苤?，安瓿裝1~1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要完全封鎖，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記好細(xì)胞名稱和凍存日期，同時(shí)作好記錄（日期、細(xì)胞種類及代次、凍存支數(shù)）。（4）將裝好細(xì)胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內(nèi)；置于液氮容器頸口處寄存留宿，第二天轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方式也可采用下列步驟：先將安瓿置入4C冰箱中2~3小時(shí)，再移至冰箱冷凍室內(nèi)3~4小時(shí)（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態(tài)部份寄存2小時(shí)，最后沉入液氮中。散布降溫法細(xì)胞系凍存程序：1）單層細(xì)胞的消化。將經(jīng)24~48小時(shí)培育已長(zhǎng)成單層的傳代細(xì)胞培育物棄去生長(zhǎng)液，加適量ATV,1~2分鐘后倒棄ATV，再加入少量ATV液，經(jīng)0.5~1分鐘倒去ATV，室溫或37oC溫箱作用2~3分鐘，視細(xì)胞解離情況，拍打細(xì)胞培育瓶。使單層細(xì)胞完全解離。SP2/0瘤細(xì)胞，待生長(zhǎng)好后用吸管吹打，再經(jīng)1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。2）離心洗滌：向培育瓶?jī)?nèi)加5~10m1預(yù)冷的MEM使細(xì)胞懸浮，再將其吸出置滅菌離心管中，以1000rpm離心8~10分鐘后棄去上清液。3）細(xì)胞懸液的制備：向離心管內(nèi)逐滴緩慢加入預(yù)冷的凍存保護(hù)液，使細(xì)胞濃度為150~400萬(wàn)/ml,然后迅速分裝于安瓿瓶中，每瓶加量為lml。致冷凍結(jié)：將安瓿瓶放入帶有棉墊的紙盒或塑料盒內(nèi)，直立置不同條件下致冷凍結(jié)果保留：a、4oC兩小時(shí)后移至一2OoC作用2小時(shí)，再移入一4OoC4小時(shí)后在一7OoC下24小時(shí)投入液氮。b，一20oC4小時(shí)后移致一4OoC。C經(jīng)4小時(shí)移人一7OoC冰箱24小時(shí)，投入液氮。c，一4OoC4小時(shí)后移入一70oC24小時(shí)后投入液氮。d、一20oC4小時(shí)后移入一70oC經(jīng)24小時(shí)后投入液氮中。e、一70oC24小時(shí)后投入液氮中。液氮中保留：將凍結(jié)后的安瓿裝入預(yù)冷的小布袋中，投入液氮。為避免安瓿漂浮，可預(yù)先在小布袋中加入幾塊小卵石。玻璃化法玻璃化保留(Vitrification)是一種超速冷凍方式。它是以極快的速度冷凍細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)外的游離水迅速形成玻璃樣物質(zhì)，而不形成冰晶。這種保留方式既避免了由于慢速降溫時(shí)致使的鹽濃度升高，又避免了由于冰晶形成造成的物理?yè)p傷，可取得較高存活率。玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他以為生命是生物活體系統(tǒng)的原子或其他結(jié)構(gòu)元的一種特殊排列.而且輕微的排列位置擾動(dòng)就會(huì)破壞平衡從而致使死亡，而結(jié)冰時(shí)的驅(qū)動(dòng)力會(huì)破壞這種特殊的排列，這就是冰凍死亡的原因。玻璃化比凍結(jié)固化方式引發(fā)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變要小，因此是一種較理想的低溫保留途徑。1981年，F(xiàn)ahy首先明確提出，用高濃度的低溫保護(hù)劑溶液，可在較慢地冷卻速度和高壓條件下實(shí)現(xiàn)完全的玻璃化，以后又發(fā)展了一些所謂〃玻璃化溶液”，使細(xì)胞、組織乃至器官等范圍普遍的生物系統(tǒng)玻璃化低溫保留成為可能。1985年，Rail和Fahy［目用這種玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保留取得成功，是這種技術(shù)走向?qū)嵱没牡谝淮螞_破。蘇醒技術(shù)細(xì)胞蘇醒的原則在實(shí)際操作中，凍存細(xì)胞要進(jìn)行蘇醒，再培育傳代。蘇醒細(xì)胞一般采用快速融化法。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。細(xì)胞蘇醒的主要操作步驟(1)佩帶眼鏡和手套，從液氮罐中掏出安瓿或冷凍管。(2)迅速放入38°C水浴中，并非時(shí)搖動(dòng)，在1分鐘內(nèi)使其完全融化，然后在無菌下掏出細(xì)胞。(3)在1000r/min速度下離心5~10分鐘，棄去上層液，加入適量培育液后接種于培育瓶中，接種濃度1X109/L,置37C溫箱靜置培育，第二天改換—次培育液，繼續(xù)培育，觀察生長(zhǎng)情況。若細(xì)胞密度較高，及時(shí)傳代?；驘o需離心'直接將細(xì)胞加入瓶中，并加入培育基貼壁培育12~24小時(shí)后，充去上清，換入新鮮培育基繼續(xù)培育。注意事項(xiàng)在細(xì)胞蘇醒操作時(shí)，應(yīng)注意融化凍存細(xì)胞速度要快，可不時(shí)搖動(dòng)安瓿或冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段(-5~0C)。這樣蘇醒的凍存細(xì)胞存活率高，生長(zhǎng)及形態(tài)良好。但是，由于凍存的細(xì)胞還受其他因素的影響，有時(shí)也會(huì)有部份細(xì)胞死亡。此時(shí)，可將不貼壁、飄浮在培育液上（已死亡）的細(xì)胞輕輕倒掉，再補(bǔ)以適量的新培育液，也會(huì)取得較為滿意的結(jié)果。技術(shù)總結(jié)要點(diǎn)冷凍速度冷凍速度也就是降溫的速度，它與冷凍效果直接相關(guān)。Morris以為在冷凍進(jìn)程中生物物理作用比生物化學(xué)作用更重要。冷凍速度、細(xì)胞收縮引發(fā)細(xì)胞膜和細(xì)胞器的轉(zhuǎn)變是造成損傷的主要因素目。冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向細(xì)胞外流動(dòng)的情況也會(huì)不同。若是冷凍速度過慢，細(xì)胞內(nèi)水額外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰；冷凍速度過快，細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠時(shí)間外滲，隨著溫度的下降，細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生結(jié)冰；若是冷凍速度超級(jí)快，細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶反而超級(jí)小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃化冷凍）。不同的冷凍速度會(huì)使細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生不同的生理轉(zhuǎn)變，一樣也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。冷凍速度過慢，細(xì)胞嚴(yán)重脫水，體積急劇收縮.超過必然程度時(shí)細(xì)胞失去活性。冷凍速度過慢會(huì)引發(fā)細(xì)胞外溶液部份結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶液損傷。冷凍速度過快，細(xì)胞內(nèi)水分來不及外滲，會(huì)在胞內(nèi)形成較大冰晶，造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的損傷，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。1937年，Luyet實(shí)液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，液體中的分子呈有序的排列；另一種為非晶體化即玻璃化，液體中的分子呈無序排列，維持未凝固前的狀態(tài)。故從細(xì)胞存活角度來講玻璃化冷凍是最為理想的凍存方式。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固。無冰晶形成或形成很小的冰晶，對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器不造成破壞；細(xì)胞也不會(huì)在高濃度溶質(zhì)的溶液中因暴露時(shí)間太長(zhǎng)而受損。不同細(xì)胞的最適冷凍速度不同，主要取決于水分滲透進(jìn)程是不是與降溫速度相匹配；同時(shí)還取決于細(xì)胞的表面積與體積之比，和細(xì)胞膜的滲透率。一般來講。小細(xì)胞（如紅細(xì)胞等）對(duì)水通透性強(qiáng)，適用于快凍，最佳冷凍速度較高，可達(dá)103oC/min或更高；相反大的細(xì)胞或組織，如直徑100m以上的胚胎，對(duì)水的通透性弱，則適于慢凍。另外，最佳冷凍速度還受是不是應(yīng)用防凍劑、防凍劑的含量和培育的細(xì)胞所處的狀態(tài)等多方面的因素影響。目前被普遍接受的是皮膚的低溫保留中采用慢凍快復(fù)溫，一般以為降溫速度以1~5oC/min為最佳。冷凍保留溫度冷凍保留溫度是指長(zhǎng)久保留細(xì)胞的超低溫度，在此溫度下，細(xì)胞生化反映極為緩慢乃至停止。經(jīng)太長(zhǎng)期保留的細(xì)胞和組織在蘇醒后仍能保留正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保留溫度可以隨著不同的細(xì)胞和生物體和不同的冷凍保留方式而不同。液氮溫度（-196。。是目前最佳冷凍保留溫度。在-196oC時(shí)，細(xì)胞生命活動(dòng)幾乎停止，但蘇醒后細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完好。應(yīng)用-70~-80oC條件冷凍保留細(xì)胞，短時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響，但隨著凍存時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯降低。在0~40oC范圍內(nèi)保留細(xì)胞效果不佳。蘇醒復(fù)溫速度是指在細(xì)胞蘇醒時(shí)溫度升高的速度。冷凍保留體外培育物，除必需有最佳的冷凍速度、適合的冷凍保護(hù)劑和凍存溫度外，在蘇醒時(shí)也需要有最佳的復(fù)溫速度，這樣才能保證最終得最佳冷凍保留效果。與冷凍進(jìn)程相較，復(fù)溫進(jìn)程的研究顯得薄弱得多。復(fù)溫速度不妥一樣會(huì)造成細(xì)胞損傷，降低凍存細(xì)胞存活率。其損傷發(fā)生超級(jí)快，持續(xù)時(shí)間也很短，原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通過對(duì)酵母細(xì)胞的冷凍研究發(fā)現(xiàn)，冷凍進(jìn)程中胞內(nèi)形成的冰晶并未對(duì)細(xì)胞造成致命的損傷，反而是在復(fù)溫進(jìn)程中，復(fù)溫到-40°C或更高的溫度時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)從頭形成較大冰晶而造成細(xì)胞的致命損傷。常規(guī)的做法是，在37C水浴中，于1—2min內(nèi)完成復(fù)溫，也就是通常采用的快速蘇醒。因此，最佳復(fù)溫速度與最佳冷凍速度對(duì)保證取得最佳凍存效果同樣重要。凍存保護(hù)劑凍存保護(hù)劑(Cryoprotectant)是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)(常為溶液)。細(xì)胞懸液中加入冷凍保護(hù)劑可保護(hù)細(xì)胞免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護(hù)劑同溶液中的水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，弱化水的結(jié)晶進(jìn)程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成.同時(shí)冷凍保護(hù)劑可以通過在細(xì)胞內(nèi)夕卜維持必然的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)夕卜未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷。冷凍保護(hù)劑按照其是不是穿透細(xì)胞膜可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護(hù)劑多是一些小分子物質(zhì)，可以透過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)。該類保護(hù)劑主要包括二甲基亞砜(DimethylSulfoxide,DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外卜未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷同時(shí)。細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過額外滲，避免了細(xì)胞過度脫水皺縮。在利用該類冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一按時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前利用較多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。