轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)及其應(yīng)用

關(guān)于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)及其應(yīng)用第1頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六一、轉(zhuǎn)錄組簡介1、概念2、轉(zhuǎn)錄組學(xué)3、相關(guān)知識第2頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六1、概念

遺傳學(xué)中心法則表明,遺傳信息在精密的調(diào)控下通過信使RNA(mRNA)從DNA傳遞到蛋白質(zhì)。因此,mRNA被認(rèn)為是DNA與蛋白質(zhì)之間生物信息傳遞的一個“橋梁”,而所有表達(dá)基因的身份以及其轉(zhuǎn)錄水平,綜合起來被稱作轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)。轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和,主要包括mRNA和非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)。第3頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六2、轉(zhuǎn)錄組學(xué)

研究生物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的發(fā)生和變化規(guī)律的科學(xué)就稱為轉(zhuǎn)錄組(transcriptomics)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics），是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。簡而言之，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況。第4頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六3、相關(guān)知識（1）四大組學(xué)基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)組代謝組解釋人類生老病死奧秘的四大組學(xué)第5頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六（2）基因組學(xué)基因組學(xué)（英文genomics），研究生物基因組和如何利用基因的一門學(xué)問。用于概括涉及基因作圖、測序和整個基因組功能分析的遺傳學(xué)分支。該學(xué)科提供基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用，試圖解決生物，醫(yī)學(xué)，和工業(yè)領(lǐng)域的重大問題。第6頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六1基因組發(fā)展趨勢圖第7頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六（3）蛋白質(zhì)組學(xué)第8頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六蛋白質(zhì)組學(xué)（proteome）一詞，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome）兩個詞的雜合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識，這個概念最早是在1995年提出的。蛋白質(zhì)組的研究不僅能為生命活動規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為眾多種疾病機(jī)理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑第9頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六（4）代謝組學(xué)

代謝組學(xué)(metabonomics／metabolomics)是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想，對生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究方式，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其研究對象大都是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。先進(jìn)分析檢測技術(shù)結(jié)合模式識別和專家系統(tǒng)等計算分析方法是代謝組學(xué)研究的基本方法。第10頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六代謝組學(xué)研究進(jìn)展第11頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六二、主要技術(shù)及其原理1、基因芯片技術(shù)(Microarray)2、基因表達(dá)系列分析技術(shù)(Serialanalysisofgeneexpression，SAGE)3、大規(guī)模平行測序技術(shù)(Massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS)4、RNA測序技術(shù)(RNAsequencing，RNA-seq)。第12頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六1、基因芯片技術(shù)(Microarray)在轉(zhuǎn)錄組研究中應(yīng)用最早及最廣泛的為基因芯片技術(shù)(Microarray)，首先從待檢測樣品中提取RNA，并利用熒光標(biāo)記的核苷酸將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)過標(biāo)記的核苷酸序列可與基因芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，經(jīng)檢測雜交信號而獲取細(xì)胞基因表達(dá)信息。第13頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六基因芯片原理圖第14頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六2、基因表達(dá)系列分析技術(shù)(SAGE)基因表達(dá)系列分析技術(shù)技術(shù)是一種基于測序技術(shù)、開放式的、快速高效的分析細(xì)胞基因表達(dá)狀態(tài)的方法，該技術(shù)不需任何基因序列的信息，能夠全局性地檢測所有基因的表達(dá)水平。第15頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六3、大規(guī)模平行測序技術(shù)(MPSS)MPSS技術(shù)是對SAGE技術(shù)的改進(jìn)，但其原理都是基于短標(biāo)簽測序(Tag-basedsequencing)的方法。MPSS技術(shù)可獲得更長的短標(biāo)簽，因而精度更高；此外，MPSS技術(shù)特有的微球熒光測序可直接高通量讀出序列，簡化了測序過程。第16頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六4、RNA測序技術(shù)(RNAsequencing，RNA-seq)

RNA測序技術(shù)(RNA-seq)新一代高通量基因組測序儀的迅速發(fā)展(Solexa，454GS-FLX，SOLiD，tSMS)不僅給基組領(lǐng)域帶來革命性的突破，同時也給轉(zhuǎn)錄組檢測方法帶來重大革新。采用類似SAGE技術(shù)和MPSS技術(shù)的理念，新一代高通量基因組測序儀可以通過測定細(xì)胞全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列，通過序列比對得到最后的轉(zhuǎn)錄組，一個新的測定轉(zhuǎn)錄組的“RNA測序”法出現(xiàn)了，該技術(shù)稱為RNA測序技術(shù)(RNA-seq)。RNA-seq技術(shù)可以提供更多信息，可以得到用基因芯片難以得到的轉(zhuǎn)錄可變剪接序列；該技術(shù)對低表達(dá)基因的檢測更加準(zhǔn)確，并且可以定量確定轉(zhuǎn)錄水平。第17頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六

RNA-Seq原理

把上述高通量測序技術(shù)應(yīng)用到由mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上,從而獲得來自不同基因的mRNA片段在特定樣本中的含量,這就是mRNA測序或mRNA-Seq,同樣原理,各種類型的轉(zhuǎn)錄本都可以用深度測序技術(shù)進(jìn)行高通量檢測,統(tǒng)稱作RNA-Seq。該技術(shù)[3]首先將細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫(利用最新的SMS技術(shù)可略去這一步,直接對RNA進(jìn)行測序[19]),然后將cDNA文庫中的DNA隨機(jī)剪切為小片段(或先將RNA片段化后再反轉(zhuǎn)錄),在cDNA兩端加上接頭利用新一代高通量測序儀測序,直到獲得足夠的序列,所得序列通過比對(有參考基因組)或從頭組裝(denovoassembling)(無參考基因組)形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄第18頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六1RNA-Seq實驗流程圖第19頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六RNA-Seq技術(shù)優(yōu)勢1(1)數(shù)字化信號；直接測定每個轉(zhuǎn)錄本片段序列,單核苷酸分辨率的精確度,可以檢測單個堿基差異、基因家族中相似基因以及可變剪接造成的不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá),同時不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應(yīng)和背景噪音問題,能覆蓋信號超高的動態(tài)變化范圍。(2)高靈敏度：能夠檢測到細(xì)胞中少至幾個拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本。(3)任意物種的全基因組分析；無需預(yù)先設(shè)計特異性探針,因此無需了解物種基因信息,能夠直接對任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,這對非模式生物的研究尤為重要,例如Wang等、Xiang等和Vera等利用RNA-Seq技術(shù)分別對白粉虱、海鱸魚和蝴蝶轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究。同時能夠檢測未知基因,發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本,并精確地識別可變剪切位點(diǎn)及cSNP,UTR區(qū)域。第20頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六(4)更廣的檢測范圍：高于6個數(shù)量級的動態(tài)檢測范圍,能夠同時鑒定和定量稀有轉(zhuǎn)錄本和正常轉(zhuǎn)錄本;而芯片對過低或過高表達(dá)的基因缺乏敏感性,因而動態(tài)檢測范圍小。此外,RNA-Seq重復(fù)性好,無需技術(shù)重復(fù),而且起始樣品比芯片技術(shù)要少得多,尤其適用于來源極為有限的生物樣品分析,如癌癥干細(xì)胞。第21頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六三、與蛋白質(zhì)組研究進(jìn)展比較

轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組比較研究發(fā)現(xiàn)，總體而言其間的相關(guān)性不高。根據(jù)數(shù)據(jù)的類型不同可以將現(xiàn)有的研究分為4類：單點(diǎn)比較、兩點(diǎn)差異比較、多點(diǎn)時序比較和多點(diǎn)非時序比較。對其差異原因的研究和分析表明：除了由實驗系統(tǒng)及數(shù)據(jù)類型不同導(dǎo)致的差異外，轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)合成各步驟受到的限制，以及在此過程中的分子調(diào)控也對其有重要的影響；而且不同基因，不同組織和細(xì)胞在不同狀態(tài)下可能也會有差異。因此，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的表達(dá)譜研究傾向于利用蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組研究的差異和互補(bǔ)性，同時對生物體特定狀態(tài)下的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行全方位度量，以獲得表達(dá)譜的全景圖，并挖掘受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的基因。第22頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六四、轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用

1、轉(zhuǎn)錄組在代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用2、轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥用植物研究中的應(yīng)用

3、轉(zhuǎn)錄組學(xué)在植物細(xì)胞特性的改造方面的應(yīng)用

第23頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六1、轉(zhuǎn)錄組在代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用動物細(xì)胞系目前已經(jīng)被廣泛用于蛋白質(zhì)藥物等產(chǎn)品的大量生產(chǎn)上，利用動物細(xì)胞表達(dá)蛋白其優(yōu)勢在于有助于蛋白質(zhì)正確折疊、組裝并進(jìn)行翻譯后的修飾，目標(biāo)蛋白質(zhì)可正常行使其功能。轉(zhuǎn)錄組分析在減少細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)、控制細(xì)胞貼壁性、調(diào)控細(xì)胞生長活性等方面都有成功的應(yīng)用第24頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六1第25頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六2、轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥用植物研究中的應(yīng)用目前，1/3以上的臨床用藥來源于植物提取物或其衍生物。隨著分子生物學(xué)向各個學(xué)科領(lǐng)域的滲透及蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的應(yīng)用，闡明藥用植物天然活性成分生物合成途徑及其關(guān)鍵酶，實現(xiàn)關(guān)鍵酶基因的克隆與體外高效表達(dá)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段及次生代謝工程，大規(guī)模生產(chǎn)藥用植物的有效成分將成為未來發(fā)展方向之一。第26頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六

通過對物種的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行描述，能夠?qū)斫馕锓N的生物學(xué)和生物化學(xué)的各個方面提供新的信息。雖然藥用植物有效成分的化學(xué)和藥理學(xué)研究已經(jīng)具有良好的基礎(chǔ)，但是在天然活性成分生物合成途徑和調(diào)控方面研究還很薄弱。目前，該領(lǐng)域的研究主要集中在長春花、青蒿、紅豆杉和甘草等少數(shù)物種，這些研究多采用單基因研究策略。例如ColluG.等將候選細(xì)胞色素P450基因轉(zhuǎn)化長春花的懸浮細(xì)胞，驗證了其具有10-香葉醇羥化酶的催化功能；SekiH.等利用昆蟲外源體內(nèi)共表達(dá)和酵母體外表達(dá)檢驗酶活的方法鑒定了甘草中的三萜甘草酸合成關(guān)鍵酶基因；WildungMR&CroteauR.A采用同源探針篩選太平洋參紫杉cDNA文庫并結(jié)合GC-MS的方法，鑒定了紫杉醇生物合成中的關(guān)鍵酶TaxadieneSynthase基因第27頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六第28頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六3、轉(zhuǎn)錄組學(xué)在植物細(xì)胞特性的改造方面的應(yīng)用

植物的生長發(fā)育及產(chǎn)量與外界環(huán)境密切相關(guān)，通過代謝工程手段可以顯著提高植物對環(huán)境脅迫的抗性，保護(hù)植物免受外界環(huán)境的不良影響。Seki等對擬南芥轉(zhuǎn)錄組分析，得到了44個受干旱誘導(dǎo)基因以及19個受冷誘導(dǎo)的基因，其中有12個基因被確定為植物脅迫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子CBF/DREB(C-repeat-binding-factor/dehydration-responsive-element-binding)的靶基因。這些靶基因的確認(rèn)對深入認(rèn)識植物產(chǎn)生環(huán)境脅迫抗性的機(jī)理具有重要意義。Benedict等將擬南芥的冷脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子CBF1轉(zhuǎn)入楊樹，使其冷耐受性明顯增強(qiáng)，同時發(fā)現(xiàn)楊樹中受擬南芥CBF1調(diào)控的基因與擬南芥中相應(yīng)基因具有高度一致性。該研究指出CBF/DREB1冷調(diào)控機(jī)制可增強(qiáng)植株對多種逆境的抵抗性第29頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六第30頁，共32頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)48分，星期六五、參考文獻(xiàn)

【1】轉(zhuǎn)錄組研究新技術(shù)：RNA-Seq及其應(yīng)用祁云霞,劉永斌,榮威恒遺傳HEREDITAS(Beijing)2011年11月,33(11):1191―1202ISSN0253-9772【2】轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組的比較研究進(jìn)展吳松峰、朱云平、賀福