真核轉(zhuǎn)染穩(wěn)定篩選標(biāo)記及原理課件

真核細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選標(biāo)記及原理小組：周四班二組

組員：薛瑩超（報告者）

滕達(dá)曾欣宜

席杰賴惠英鄧宇星

外源基因表達(dá)的三個概念

轉(zhuǎn)染通過生化或者物理方法將目的基因?qū)胝婧思?xì)胞中。分類

轉(zhuǎn)導(dǎo)通過病毒介導(dǎo)，用基因組中攜帶有克隆目的片斷的病毒來感染靶細(xì)胞。轉(zhuǎn)化通過生化或者物理方法將目的基因?qū)朐思?xì)胞中。常用的真核表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)

理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高、細(xì)胞毒性很低，但準(zhǔn)備程序復(fù)雜，對細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性很難普及。非病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)中，以陽離子非脂性物質(zhì)為主的混合物配方轉(zhuǎn)染效率最高。該類轉(zhuǎn)染具有廣譜、細(xì)胞毒性小、性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，且不受培養(yǎng)液中的血清和抗生素的干擾，比脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法更方便。轉(zhuǎn)染后的表達(dá)1.瞬時表達(dá)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，一部分轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄輸出mRNA進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。幾天內(nèi)大部分的質(zhì)粒都會被降解或傳代而稀釋。一周以后幾乎檢測不到。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不整合到染色體上，出現(xiàn)短暫的（24-96h）高水平表達(dá)，依賴于質(zhì)粒純度、濃度和轉(zhuǎn)染效率。2.穩(wěn)定表達(dá)

轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA整合到染色體上可以持續(xù)存在，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以長期表達(dá)。

整合的概率比較小，要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株需要篩選標(biāo)記共同轉(zhuǎn)染，通過選擇壓力維持表達(dá)穩(wěn)定。需要長時間的抗性選擇培養(yǎng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)常用的選擇性標(biāo)記營養(yǎng)缺陷性酵母trp1-，ura3-，his3-，leu2-，lys2-。顯性選擇標(biāo)記，用于野生型酵母菌的轉(zhuǎn)染。G418篩選。細(xì)胞內(nèi)DNA的合成途徑細(xì)胞的DNA合成有主要途徑和旁路途徑兩種方式1.主要途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸脲甘酸在二氫葉酸還原酶的催化下合成DNA2.旁路途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化下補(bǔ)救合成DNA。二氫葉酸還原酶（DHFR）基因選擇系統(tǒng)遺傳標(biāo)記：DHFR：真核細(xì)胞生物合成核苷酸的關(guān)鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸編碼產(chǎn)物：二氫葉酸還原酶（DHFR）篩選藥物：葉酸類似物——氨基喋呤或氨甲喋呤作用機(jī)理：dhfr—缺陷型細(xì)胞因不能合成核酸而死亡，而導(dǎo)入了外源基因的細(xì)胞成功存活，并且在氨甲喋呤的選擇壓力下大量表達(dá)蛋白。新霉素抗性基因選擇系統(tǒng)遺傳標(biāo)記：APH編碼產(chǎn)物：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶篩選藥物：新霉素，即G418一種氨基糖苷類抗生素，影響80S核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成作用機(jī)理：新霉素抗性基因編碼3磷酸轉(zhuǎn)移酶降解G418。適用于所有的真核細(xì)胞氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因選擇系統(tǒng)遺傳標(biāo)記：CAT，大腸桿菌Tn9轉(zhuǎn)座子編碼的催化氯霉素

乙?；磻?yīng)的蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶篩選藥物：氯霉素作用機(jī)理：真核細(xì)胞缺乏CAT，將CAT作為報告基因與目的基因一起導(dǎo)入到真核細(xì)胞，可在加入氯霉素的培養(yǎng)基中選擇陽性細(xì)胞。常用于瞬時