生化藥品概述課件

第九章生化藥品概述12/5/20221生化藥品概念從生物體分離、純化所得的一類結(jié)構(gòu)上十分接近于人體內(nèi)的正常生理活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)人體生理功能，達(dá)到預(yù)防和治療疾病目的的物質(zhì)。12/5/20222第一節(jié)生化藥品分類氨基酸及其衍生物類多肽及蛋白質(zhì)類酶類核酸及其降解物和衍生物糖類脂類12/5/20223胰島素：豬、牛、人；菘藍(lán)：板藍(lán)根、大青葉；微生物：抗生素、蛋白質(zhì)、酶等；12/5/202252、種類多、含量低

紅豆杉——紫杉醇含量0.003%，約從38000棵紫杉樹中方可分離提純得到99％純度的紫杉醇約25kg，2000美元/克12/5/202263、種屬特性豬胰島素牛胰島素活性低高抗原性低高與人胰島素結(jié)構(gòu)相似性大小12/5/202274、活性與結(jié)構(gòu)相關(guān)5、制備要求高12/5/20228一、生物材料的選擇

1.來源應(yīng)選用來源豐富的材料，盡量不與其他產(chǎn)品爭(zhēng)原料，最好能一物多用，綜合利用。胰臟制備彈性蛋白酶和激肽釋放酶，胰島素與胰酶等。12/5/2022103.有效成分的含量（1）合適的生物品種：催乳素，哺乳動(dòng)物（2）合適的組織器官：（胃蛋白酶，胃）（3）生物的生長期：胸腺素，幼齡動(dòng)物（4）合適的種屬：人，豬（5）合適的生理狀態(tài)：胰島素，飯后12/5/202212（一）組織與細(xì)胞的破碎物理法化學(xué)法生物法三、生物材料預(yù)處理

12/5/2022141.物理法（1）磨切法工業(yè)：絞肉機(jī)，刨胰機(jī)，球磨機(jī)、磨粉機(jī)。實(shí)驗(yàn)室：勻漿機(jī)，研缽，高速組織搗碎機(jī)。（2）壓力法有壓榨法、高壓法和減壓法，滲透壓法。（3）超聲波法（4）反復(fù)凍融法12/5/202215超聲細(xì)胞破碎儀

高壓細(xì)胞破碎儀12/5/2022162.化學(xué)法

用稀酸、稀堿、濃鹽、有機(jī)溶劑或表面活性劑處理細(xì)胞，可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)釋放出內(nèi)容物。12/5/202217（1）組織自溶法利用組織中自身溶解酶的作用改變、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放出目的物稱為組織自溶法。(2)酶解法用外來酶處理生物材料，如用溶菌酶處理某些細(xì)菌，蝸牛酶等3.生物法

12/5/202218（二）細(xì)胞器的分離

為獲得結(jié)合在細(xì)胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到細(xì)胞器再進(jìn)一步分離有效成分。方法是勻漿破碎細(xì)胞，差速離心。12/5/202220（三）制備丙酮粉12/5/202221（一）物質(zhì)的性質(zhì)與提取方法的選擇

要取得好的提取效果，最重要的是要針對(duì)生物材料和目的物的性質(zhì)選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。

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其中最主要的是目的物與主要雜質(zhì)在溶解度方面的差異以及它們的穩(wěn)定性。操作者可根據(jù)文獻(xiàn)資料及本人的試驗(yàn)摸索獲得的有關(guān)信息，在提取過程中增加目的物的溶出度，盡可能減少雜質(zhì)的溶出度。

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（2）添加保護(hù)劑

防止某些生理活性物質(zhì)的活性基團(tuán)及酶的活性中心受到破壞，巰基，極易被氧化，故提取時(shí)，常添加某些還原劑如半胱氨酸，－巰基乙醇。對(duì)易受重金屬影響的，可添加EDTA等螯合劑。12/5/202226（3）抑制水解酶的作用：抑制劑、熱等。（4）其它保護(hù)措施：冷、熱、酸、堿12/5/202227１、溫度提取溫度↑溶解度↑。溫度↑物料的粘度↓，有利于分子擴(kuò)散和機(jī)械攪拌，對(duì)不耐熱的生物活性物質(zhì)的提取，一般在0~10℃進(jìn)行提取。（三）影響提取的因素

12/5/202228鹽溶作用：鹽離子作用于生物大分子表面，增加了表面電荷，使之極性增加，水合作用增強(qiáng)，促使其形成穩(wěn)定的雙電層，此現(xiàn)象為鹽溶作用。鹽析作用：指溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程

３、鹽濃度

12/5/202230（四）提取方法

１、用酸、堿、鹽水溶液提取12/5/202231２、表面活性劑提取

表面活性劑分子兼有親水與疏水基團(tuán)，分布于油水界面時(shí)，有分散、乳化和增溶作用。表面活性劑分陰離子型、陽離子型與非離子型。離子型表面活性劑作用強(qiáng)，但是易引起蛋白質(zhì)等生物大分子的變性，非離子表面活性劑變性作用小，適合于用水、鹽系統(tǒng)無法提取的蛋白質(zhì)或酶的提取。12/5/202232⑴.固－液提取丙酮從動(dòng)物腦中提取膽固醇，溶劑分級(jí)提?。喝缦扔帽?，再用乙醇，最后用乙醚提取。石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。

３、有機(jī)溶劑提取

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相似相溶

物質(zhì)的性質(zhì)與溶解度

12/5/202234⑵.液－液萃取

液－液萃取是利用溶質(zhì)在兩個(gè)互不混溶的溶劑中溶解度的差異，將溶質(zhì)從一個(gè)溶劑相向另一個(gè)溶劑相轉(zhuǎn)移的操作。分配系數(shù)和溶劑用量12/5/202235殘留量計(jì)算公式

Xn=X0ｋｍｎ

ｋｍ＋ｖＸ０

：目的物總量（ｇ）Ｋ：分配系數(shù)，ｋ大，Xn大Ｖ：溶劑體積（ｍｌ），ｖ大，Xn小，ｖ＝２－５倍ｍ：生物材料重量（ｇ）ｎ：提取次數(shù)，ｎ大，Xn小，ｎ＝２－３次12/5/202236（一）鹽析濃縮：硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)（二）有機(jī)溶劑沉淀濃縮在生物大分子的水溶液中，逐漸加入乙醇，丙酮等有機(jī)溶劑，可以使生化物質(zhì)的溶解度明顯降低，從溶液中沉淀出來。四、生物活性物質(zhì)的濃縮與干燥

12/5/202237（三）用葡聚糖凝膠（Sephadex）濃縮（四）用聚乙二醇透析濃縮（五）超濾濃縮（六）真空減壓濃縮與薄膜濃縮真空減壓濃縮在藥物生產(chǎn)中使用較為普遍，具有生產(chǎn)規(guī)模較大，蒸發(fā)溫度較低，蒸發(fā)速度較快等優(yōu)點(diǎn)。薄膜濃縮器的加速蒸發(fā)的原理是增加汽化表面積。12/5/20223812/5/202239（七）干燥的目的：提高藥物或藥劑的穩(wěn)定性，以利于保存和運(yùn)輸；達(dá)到規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)；便于進(jìn)一步處理。（八）干燥方法：減壓干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等。

12/5/20224012/5/202241冷凍干燥機(jī)12/5/202242

１、生物制藥中分離制備方法的特點(diǎn)（1）生物材料組成非常復(fù)雜。一種生物材料常含成千上萬成分，各種化合物的形狀、大小、分子量和理化性質(zhì)都各不相同。沒有固定操作方法。五、生化物質(zhì)的分離純化方法

12/5/202243（2）有些化合物在生物材料中含量極微，只達(dá)萬分之一，甚至百萬分之一。因此，分離操作步驟多，不易獲得高收率。12/5/202244（3）生物活性物質(zhì)離開生物體后，易變性，破壞，分離進(jìn)程必須十分小心的保護(hù)這些化合物的生理活性。12/5/202245（4）生物制藥的分離方法幾乎都在溶液中進(jìn)行，各種參數(shù)（溫度，pH，離子強(qiáng)度）對(duì)溶液中各種組分的綜合影響常常無法固定，以致許多實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理論性不強(qiáng)。12/5/202246（5）為了保護(hù)目的物的生理活性及結(jié)構(gòu)上的完整性，生物制藥中的分離方法多采用溫和的逐級(jí)分離方法。親和層析分離具有分離的專一性，高效性。12/5/202247（6）生物產(chǎn)品最后均一性的證明與化學(xué)純度的概念不完全相同，因生物分子對(duì)環(huán)境反應(yīng)十分敏感，結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系比較復(fù)雜。12/5/202248２、基本原理（1）根據(jù)分子形狀和大小不同進(jìn)行分離：如差速離心與超離心、

膜分離（透析，電滲析）與超濾，

凝膠過濾法。12/5/202249（2）根據(jù)分子電離性質(zhì)的差異性進(jìn)行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法。12/5/202250（3）根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進(jìn)行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點(diǎn)沉淀法，及有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法。12/5/202251（4）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進(jìn)行分離。如選擇性吸附法

吸附層析法。（5）根據(jù)配體特異性進(jìn)行分離：親和層析法。12/5/202252３、分離純化的基本程序和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

生物體內(nèi)某一組分，特別是未知結(jié)構(gòu)的組分的分離制備設(shè)計(jì)大致上分為五個(gè)基本階段。12/5/202253（1）確定制備物的研究目的及建立相應(yīng)的分析鑒定方法。（2）制備物理化性質(zhì)穩(wěn)定性的預(yù)備試驗(yàn)。（3）材料處理及抽提方法的選擇。（4）分離純化方法的摸索。（5）產(chǎn)物均一性測(cè)定。12/5/202254

⑴.分離純化早期使用方法的選擇早期分離純化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法較為有利，這些方法負(fù)荷能力大，分離量多兼有分離提純和濃縮的作用，為進(jìn)一步分離純化創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。

４、分離純化的策略：12/5/202255⑵.各種分離純化方法的使用程序

在相同或相似條件下連續(xù)使用同一種分離方法就不太適宜。在安排純化方法順序時(shí)，還要考慮到有利于減少工序，提高效率。（鹽析－吸附，吸附－鹽析）對(duì)于一未知物通過各種方法的交叉應(yīng)用，有助于進(jìn)一步了解目的物的性質(zhì)。12/5/202256⑶.分離后期的保護(hù)性措施

在分離操作的后期必須注意避免產(chǎn)品的損失，主要損失途徑是器皿的吸附，操作過程樣品液體的殘留，空氣氧化和某些事先無法了解的因素。12/5/202257５、分離純化方法步驟優(yōu)劣的綜合評(píng)價(jià)

分辨能力重現(xiàn)性回收率比活性

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離心技術(shù)沉降作用—懸浮液靜置時(shí)，在重力作用下，密度大于周圍溶液的固體顆粒逐漸下沉，稱為沉降作用。離心技術(shù)—在離心力場(chǎng)作用下，加速懸浮液中固體顆粒沉降速度的方法稱為離心技術(shù)。相對(duì)離心力—通常用離心力與重力的比值表示離心機(jī)的離心能力，也稱分離因素，用符號(hào)×g或g表示。12/5/202259r為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；N為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。12/5/202260離心機(jī)

1．按轉(zhuǎn)速高低來分（1）普通離心機(jī)，小于6000rpm（2）高速離心機(jī)，8000~25000rpm（3）超速離心機(jī)，25000~80000rpm12/5/2022612．按工作性質(zhì)分類（1）制備型離心機(jī)（2）實(shí)驗(yàn)室用離心機(jī)3．按操作方式分類（1）連續(xù)離心機(jī)

（2）人工卸料（出渣）離心機(jī)；（3）自動(dòng)卸料離心機(jī)（如螺旋式離心機(jī)）12/5/202262臥式螺旋卸料沉降離心機(jī)12/5/202263

膜分離技術(shù)分離范圍分離動(dòng)力一般過濾>1μm壓力差微孔過濾0.01~1μm壓力差透析5~100?分子擴(kuò)散超級(jí)過濾5~100?壓力差反滲透<5?壓力差電滲析<5?電能12/5/202264海水脫鹽淡化醫(yī)藥工業(yè)的純化水、注射用水生物大分子物質(zhì)的濃縮與純化人工腎透析過濾除菌（溶液、空氣）應(yīng)用范圍返回12/5/202265

凝膠層析

它是將樣品化合物通過一定孔徑的凝膠固定相，用于流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組成得以分離的層析。12/5/202266VC大分子小分子返回12/5/202267離子交換法是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離的操作方法。帶電粒子與離子交換劑間的作用力是靜電力。它們結(jié)合是可逆的，在一定條件下能夠結(jié)合，條件改變后也能被釋放出來。離子交換劑由惰性的不溶性載體，功能基團(tuán)和平衡離子組成。離子交換法

12/5/202268X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋X＋Z＋X＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上樣吸附洗雜洗脫返回12/5/202269

固相析出分離法改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出的操作技術(shù)稱為固相析出分離法。析出物為晶體時(shí)稱為結(jié)晶；析出物為無定形固體稱為沉淀法。固相析出法主要有鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法，結(jié)晶法等。12/5/202270鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。12/5/202271鹽析的機(jī)制高濃度的中性鹽溶液中存在著大量的帶電荷的鹽離子，它們能夠中和生物分子表面的電荷，使之賴以穩(wěn)定的雙電層受損，從而破壞分子外圍的水化層；另外，大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，從另一方面摧毀了水化層，使生物分子相互聚集而沉淀。12/5/20227212/5/20227312/5/202274向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。有機(jī)溶劑沉淀法

12/5/202275主要機(jī)理：（1)親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使得溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。(2)水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。12/5/202276等電點(diǎn)沉淀法

兩性電解質(zhì)，在溶液pH處于等電點(diǎn)（pI）時(shí)分子表面凈電荷為零，導(dǎo)致賴以穩(wěn)定的雙電層及水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。調(diào)節(jié)溶解的pH值，使兩性溶質(zhì)溶解度下降，析出沉淀的操作。12/5/202277

改變?nèi)芤旱哪承l件，使其中的溶質(zhì)以結(jié)晶態(tài)析出的過程稱作結(jié)晶。結(jié)晶法

12/5/202278鹽析結(jié)晶法請(qǐng)?jiān)诖随I入您自己的內(nèi)容Cytc12/5/202279化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法

12/5/202280

吸附法

吸附是物質(zhì)分子在兩相界面上濃度的增加。我們稱物質(zhì)從流動(dòng)性（氣或液相）濃縮到固體表面從而達(dá)到分離的過程稱為吸附作用。把在表面上能發(fā)生吸附作用的固體稱為吸附劑；將被吸附的物質(zhì)稱為吸附物。12/5/202281預(yù)處理上樣吸附洗雜洗脫再生12/5/202282常用吸附劑：1)活性炭是一種吸附能力很強(qiáng)的非極性吸附劑，其吸附作用在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中較弱，吸附能力的順序：水>乙醇>甲醇>乙酸乙酯>丙酮>氯仿。2)人造沸石人造沸石是一種人工合成的無機(jī)陽離子交換劑。用于細(xì)胞色素C的分離。12/5/2022833)磷酸鈣凝膠在蛋白質(zhì)的分離、精制中，較為常用的吸附劑為磷酸鈣凝膠。（羥基磷灰石）活性部位為鈣離子。4)白陶土5)氫氧化鋁凝膠用于蛋白質(zhì)及酶的分離12/5/2022846)氧化鋁活性氧化鋁是最常用的一種吸附劑，特別適于親脂性成分的分離，廣泛地用于在醇，酚，生物堿，染料，甾體化合物，苷類，氨基酸，蛋白質(zhì)以及維生素等物質(zhì)的分離。7)硅膠最常用12/5/2022858)滑石粉惰性助濾劑9)硅藻土惰性助濾劑10)皂土11)聚酰胺粉12)大孔網(wǎng)格聚合物吸附樹脂極性，弱極性，非極性大孔吸附樹脂強(qiáng)酸性，弱酸性，強(qiáng)堿性，弱堿性等返回12/5/202286

利用生物大分子特異性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)稱為親核層析。在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)稱為配基（Ligand），與配基結(jié)合的層析介質(zhì)稱為載體（Matrix）親和層析

LSLS＋配基樣品12/5/202287親和層析的過程：1)配基固定化選擇合適的配基與不溶性的支撐載體偶聯(lián)，或共價(jià)結(jié)合成具有特異性親和性分離介質(zhì)。L＋L12/5/2022882)吸附樣品親和層析介質(zhì)選擇性吸附酶或其它生物活性物質(zhì)，雜質(zhì)與層析間沒有親和作用，故不能被吸附而被洗滌去除。S＋S＋雜質(zhì)LL12/5/2022893)樣品洗脫選擇適宜的條件使被吸附的親