生態(tài)毒理學6課件

研究生物富集的方法2.4研究生物富集的方法

生物富集的研究，可在個體（單獨生物種）和食物鏈兩個水平上進行。前述的許多富集規(guī)律就是在個體水平研究的基礎上得出的。無論在哪個水平上的研究，都可以采取野外采樣調(diào)查、室內(nèi)分析的方法和室內(nèi)模擬實驗的方法。

前者的優(yōu)點在于污染物的富集是各種因素綜合作用的結果，與實際情況相符；后者的優(yōu)點在于影響富集的各種因素便于控制，便于分析各個因素各自的作用和它們的綜合作用。也可以將兩種方法結合，互相印證。2.4.1模擬研究

模擬研究的方法是在一個容器內(nèi)，栽培和放養(yǎng)若干種生物，并按食物、營養(yǎng)關系組成若干條食物鏈。在這樣的生態(tài)系統(tǒng)中，研究污染物在食物鏈中的遷移、富集規(guī)律。

實驗設計

將放射性標記農(nóng)藥涂在石英砂、植物上或直接加入水相中。間隔一定時間后，測定砂和水中各種生物的放射性標記農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物。實驗的目的是：

(1)水相中放射性農(nóng)藥的污染速度；

(2)在生態(tài)系統(tǒng)中．農(nóng)藥對生物的毒害作用；

(3)水相和各種生物體內(nèi)，放射性農(nóng)藥代謝、變化情況；

(4)測定農(nóng)藥在各生物體內(nèi)的富集系數(shù)。

把5.0mg的14C-DDT（1%丙酮溶液）涂在高粱葉上，一個月后測定結果：調(diào)查試驗研究

確定一個污染區(qū)，以污染源為中心，調(diào)查污染物在環(huán)境(氣、水、土)中的含量、時空分布規(guī)律；生物對環(huán)境中污染物的富集規(guī)律以及污染物在生態(tài)系統(tǒng)中沿食物鏈逐級富集的規(guī)律以及對人體的危害。（一）環(huán)境調(diào)查大氣、水、土壤（二）植物調(diào)查（三）動物調(diào)查

第六章環(huán)境污染物的生態(tài)毒理學效應大綱環(huán)境污染物生態(tài)毒性作用的特點分子水平的生態(tài)毒理學效應細胞、組織及器官水平的生態(tài)毒理學效應個體水平的生態(tài)毒理學效應種群、群落及生態(tài)水平的生態(tài)毒理學效應景觀及全球水平的生態(tài)毒理學效應1.涉及面廣、范圍大，接觸污染的生物種類多、數(shù)量大環(huán)境污染物的生態(tài)效應特點環(huán)境污染物的生態(tài)效應特點2、在不同生物學水平上產(chǎn)生毒性作用環(huán)境污染物的生態(tài)效應特點3、低濃度、長時間、反復作用結果

2）引起三致作用：某些環(huán)境污染物可進入懷孕母體，通過胎盤進入胎兒引起胎盤中毒，導致死胎或流產(chǎn)，或者影響胎兒生長發(fā)育而產(chǎn)生畸形。環(huán)境污染物的生態(tài)效應特點3、低濃度、長時間、反復作用結果1984年，12月3日，美國聯(lián)合碳化物公司在印度的波爾市農(nóng)藥廠用異氰酸甲酯制造殺蟲劑，由于毒氣泄漏造成重大急性中毒事件致該市2500多人死亡。環(huán)境污染物的生態(tài)效應特點4、多種途徑進入體內(nèi)環(huán)境污染物的生態(tài)效應特點4、多種途徑進入體內(nèi)(高等植物)環(huán)境污染物的生態(tài)效應特點5、多種污染物同時存在、作用類型多樣、作用機制復雜協(xié)同相加拮抗獨立20一概述

生態(tài)系統(tǒng)污染物進入機體后，首先將導致機體一系列的生物化學變化。這些變化廣義上說可分為兩種：一種是用來保護生物體抵抗污染物的傷害，稱之為防護性生化反應。防護性生化反應的機理是通過降低細胞中游離污染物的濃度，從而防止或限制細胞組成部分發(fā)生可能的有害反應，消除對機體的影響。另一種不起這種作用，稱之為非防護性生化反應。21一概述

要確定某種污染物對環(huán)境造成的危害程度，就需要檢測并衡量其引起的生物效應。這對污染物質(zhì)的鑒定和來源分析十分有用。生物監(jiān)測就是根據(jù)化學物質(zhì)能夠引起生物效應的原理進行的。作為生物標志物，生化水平的生物效應應該有著很明顯的優(yōu)勢

；與更高層次的生物組織水平相比較，生化系統(tǒng)的改變能更為靈敏地起到指示作用。

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所討論的酶和蛋白質(zhì)系統(tǒng)與特定的有毒化學物質(zhì)產(chǎn)生的生物效應有關。在許多情況下，這些效應具有一定的普遍性，然而導致同樣的毒性效應必然會有同一個或幾個系統(tǒng)在起作用。目前對環(huán)境污染物產(chǎn)生效應的主要系統(tǒng)有：一概述24一概述

1)細胞色素P450單加氧酶是一種蛋白質(zhì)，與有機化合物在體內(nèi)的生物轉化有關，導致分子變化和有毒代謝物的活化或是鈍化。

2)金屬硫蛋白是一種低相對分子質(zhì)量能與金屬結合的蛋白質(zhì)，與重金屬的整合及代謝有關。

3)應激蛋白或熱沖擊蛋白是一組可以用不同物理條件和化學制劑誘導合成的蛋白質(zhì)。其中的一些被認為在保護細胞使其免受環(huán)境干擾中起著重要作用。另一些與各種基因的調(diào)節(jié)有關。

26二細胞色素P450

細胞色素P450(或簡稱P450)指的是轉化有機化學物質(zhì)結構混合功能氧化酶反應的一系列酶。由這些酶催化的反應一般被統(tǒng)稱為或是單加氧化酶反應。

通過影響化學物質(zhì)的結構，細胞色素P450酶可能會產(chǎn)生某種特定的無毒化合物，但是也可能大大增強化學物質(zhì)的毒性。

P450的誘導能對有機體承載的毒物含量或是有機體對環(huán)境中化學誘導物暴露程度起到靈敏的指示作用。

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用P450誘導來進行污染物的監(jiān)測有很多優(yōu)點。

1.

大多數(shù)的有毒物質(zhì)都能誘導P450作用；

2.P450是生物暴露在有毒物質(zhì)中產(chǎn)生效應最及時、最敏感的指標。

3.可以應用很多現(xiàn)代技術進行監(jiān)測。因此，這種方法在未來幾十年中仍然有著很大的發(fā)展?jié)摿?。二細胞色素P45028三金屬硫蛋白

金屬硫蛋白指的是一些相對分子質(zhì)量低的、富含半胱氨酸的，能夠結合金屬的蛋白或多肽。無論在動物界，還是在植物界和真核生物界，都能夠發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白。鎬、銅、鋅、汞、鉆、鎳、鈕、銀等重金屬都能夠誘導金屬硫蛋白的合成。由于已經(jīng)有一些科學基礎和測定金屬硫蛋白的合成與金屬化合物的方法，金屬硫蛋白可以作為指示過度暴露于有毒金屬的生物標志物，并且具有一定的優(yōu)勢。30四應激蛋白質(zhì)

近來，日益明顯地作為對環(huán)境脅迫的反應，所有細胞都經(jīng)歷著基因表達的變化。由于最開始發(fā)現(xiàn)于高溫暴露中，因此將這種反應最初被稱為熱沖擊反應。同時這種反應能被包括缺氧癥、金屬、外源異生物質(zhì)在內(nèi)的多種物理和化學脅迫誘導，所以現(xiàn)在它被稱為應激蛋白反應，與這種反應相聯(lián)系的基因表達的變化相當迅速，并導致應激蛋白質(zhì)的誘導合成與積累。

31四應激蛋白質(zhì)

應激蛋白質(zhì)作為生物標志物，主要是熱沖擊蛋白質(zhì)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白。許多被特定壓力因素(包括血紅素氫氧基和金屬硫蛋白)誘導的蛋白質(zhì)，也可以被歸入應激蛋白質(zhì)的廣義種類。但是這些蛋白質(zhì)將在其他部分加以討論。

應激蛋白質(zhì)可以作為環(huán)境污染生物標志物的理想候選指標，其原因有三個：一是它們是細胞自我保護反應的一部分；二是它們被多種多樣的環(huán)境壓力因子所誘導；三是從微生物到人的所有生物中的高度保守性。32五第二階段酶

外來化合物的生物轉化常常是有順序的反應。第一步(階段1)通常是一個氧化過程，引入了一個如羥基基團的極性部分。其后的反應包括一個第二類酶催化反應，稱其為第二階段反應或連接反應。第二階段酶(又稱結合酶)將代謝產(chǎn)物與細胞中多種高濃度水溶性內(nèi)生化合物連接。研究最廣而且或許是最重要的第二階段酶是谷胱甘肽轉移酶，UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶和硫轉移酶。33六以氧化為介質(zhì)的反應

近些年生物醫(yī)學領域中關于自由基生物學和氧化壓力方面的研究已得到加強。這些研究闡述了由內(nèi)源性或外源異生物質(zhì)引起氧自由基形成、抗氧化防御機理和超越解毒途徑的氧自由基流的毒性。近些年，對各種生物中(特別是水生動植物)暴露于環(huán)境污染物的生物體中有關氧化壓力的反應的比較研究結果表明，在該領域有可能形成有用的生物監(jiān)測方法學。

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如今研究所得結果大大推動了這一領域中的持續(xù)研究。在基于自由基生物學的實用生物標志物得到廣泛應用以前，還需要繼續(xù)研究：

1.對相關系統(tǒng)的正常生理學和環(huán)境的影響研究；

2.由暴露于多種外源異生物質(zhì)而引起的效應研究。值得注意的是氧化壓力包含了一系列復合的現(xiàn)象，因此一個單獨的反應也許不可能為此提供一個廣譜的標志物。六以氧化為介質(zhì)的反應35

生物對氧化的反應為評價各種強氧化的化學污染物效應提供了有用的方法。這一類化合物不僅包括了大氣氧化物（如O3、NOX和SO2），還有其他的直接氧化劑（如H2O2、亞硝酸鹽、氯等），以及具有氧化活性的化合物（如芳香醌、硝基芳香化合物等）。六以氧化為介質(zhì)的反應36七血紅素和卟啉

在過去的15年中，哺乳動物生態(tài)毒理學中一項關鍵性研究是利用化學性誘導產(chǎn)生的血紅素的改變作為暴露和效應的生物標志物。其所闡明的許多化學反應已被證明在低劑量和早期檢測中十分有效。這一基本的細胞途徑的改變在反應金屬/非金屬和有機物效應十分明顯。37七血紅素和卟啉

血紅素/卟啉途徑是血紅素蛋白和各種細胞色素合成的必要途徑。研究表明，一些試劑如鉛、砷、汞、PCBS,二，六氨苯和乙醇等化合物都會高度特異性地導致某一血紅素途徑的酶發(fā)生變化，并同時伴隨有尿樣中的血紅素前體和卟啉的增加。并研究了這種干擾與細胞損傷的聯(lián)系，以及與細胞損傷相關的微結構、形態(tài)變化等。38八污染對酶的抑制作用

與酶的誘導作用相反，一些環(huán)境污染物可抑制酶的活性（如腺苷三磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、蛋白磷酸酶等）。酶活性的抑制可分為不可逆性抑制、非競爭性抑制和競爭性抑制。

除上述抑制外，有些污染物是通過生成中間代謝產(chǎn)物抑制酶活性，造成生物化學損害。39

不可逆性抑制是由于污染物與酶蛋白的活性中心功能基團不可逆性結合而引起的。如有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制作用。非競爭性抑制是一種可逆抑制，污染物與酶分子的結合位置不是底物的結合位置，因此增加底物濃度，不能使抑制作用逆轉。競爭性抑制一般取決于抑制劑的濃度與底物濃度的相對比例。八污染對酶的抑制作用40九脫氧核糖核酸(DNA)變化

脫氧核糖核酸是生物體內(nèi)重要的大分子，也是生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)。DNA可以受到不同途徑的損傷，如正常細胞活動過程中的損傷；紫外線和放射性物質(zhì)的直接損傷；外源性化合物及其活性代謝產(chǎn)物與DNA結合等。

DNA發(fā)生損傷的生物學后果是嚴重的，但細胞本身具有修復能力，一旦損傷發(fā)生，修復能力迅速被誘導，各種修復酶增加并被活化。如果損傷的DNA不能被修復，則產(chǎn)生DNA結構和功能影響，導致細胞死亡或細胞突變，產(chǎn)生遺傳疾病。41九脫氧核糖核酸(DNA)變化

大量的研究表明，外源性化合物及其活性代謝產(chǎn)物能引起DNA損傷。對生物機體暴露于污染物后DNA加合物形成有不同的研究方法：①放射性標記法和薄層層析分析；②鑒定特異加合物方法，如分光光度法，層折技術、酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)等。

③現(xiàn)代分子生物學方法：彗星實驗，微核實驗，SSCP，RAPD，DGGE，RFLP等。42

化學物質(zhì)導致的DNA損傷不僅反映了作用于DNA的多種化合物質(zhì)的綜合效應，也反映了化學物質(zhì)在體內(nèi)的代謝、組織中的分布、生物可利用性和解毒作用等，反映了機體對DNA損傷的修復能力。

DNA損傷的修復是生物保持遺傳機構相對穩(wěn)定的重要因素。目前了解比較清楚的修復途徑有以下幾種。九脫氧核糖核酸(DNA)變化43光復活修復：是最簡單、最特異性的酶催化修復過程。由可見光(波長310—500nm)提供能量，光復活酶與嘧啶二聚體結合，催化解聚，使DNA恢復到原來狀態(tài)，酶即釋放，繼續(xù)參與下次修復。在原核細胞和真核細胞中均發(fā)現(xiàn)此種光復活酶。九脫氧核糖核酸(DNA)變化44切除修復：

通過切除DNA的損傷部位，再重新合成，并恢復切除的DNA序列。主要有：內(nèi)切、外切、修補DNA聚合酶催化三種方式。九脫氧核糖核酸(DNA)變化切除修復示意圖45九脫氧核糖核酸(DNA)變化復制后修復：①復制后重組修復。DNA聚合酶進行復制時，于親鏈損傷區(qū)子鏈留下800-1000個核苷酸的缺口，然后，DNA分子的姐妹鏈發(fā)生重組，缺口與末損傷的姐妹鏈相對時，以此姐妹鏈作修復模板，由DNA聚合酶及連接酶進行修復并連結。②分支移動修復。當DNA復制在損傷處受阻時，新合成的子鏈分支移動。原已解螺旋的親鏈重新纏繞，因損傷而復制受阻的短子鏈利用正常子鏈為模板修補合成。46

除此以外，還有誘導性修復和易錯修復(又稱SOS系統(tǒng))。許多因