分子生物學-復制

MolecularBiologyBiotechnologyInstituteHuDongweihudw@第三章DNA的復制

一、半保留復制Semi-conservationreplication以每條鏈為模板，按堿基互補配對原則由DNA聚合酶催化合成新的互補鏈。二、復制起點和復制子

Originofreplication(ori)andrepliconDNA復制從特定位置開始，即復制起點，然后向兩邊進行復制。原核生物DNA分子為一個復制子；而真核生物每個DNA分子有多個復制子，每個復制子長約50-200kb。二、復制起點和復制子

Originofreplication(ori)andreplicon復制起點有特殊的序列結構：

A.反向重復序列，即回文結構(palindrome)，與復制酶系統(tǒng)的識別有關；B.啟動子序列。C.呼吸區(qū)序列三、半不連續(xù)復制

Semi-discontinuousreplicationDNA生物合成方向為5'→3'延伸合成。在復制起點向兩側復制形成兩個復制叉(replicationforks)。前導鏈(leadingstrand)的合成是連續(xù)的；后續(xù)鏈(laggingstrand)以岡崎片段(Okaxakifragments)的形式分段合成，再連接。四、參與DNA復制的酶與蛋白螺旋酶(Helicase)利用ATP的能量，促使DNA在復制叉打開為單鏈。

E.coli中一種為螺旋酶I或螺旋酶III，與后續(xù)鏈的模板DNA結合沿5'→3'方向運動；第二種為Rep蛋白，和前導鏈的模板DNA結合沿3'→5'方向運動。2單鏈DNA結結合蛋白(SSBP)E.coli的SSBP為為四聚體，可可結合32bp。SSBP使單單鏈DNA呈呈伸展狀態(tài)，，有利于單鏈鏈DNA作為為模板。SSBP防止止單鏈DNA重新配對或或被降解。催化DNA不同超螺旋狀狀態(tài)之間的轉轉變。A.拓撲異構酶I：雙鏈解旋切斷形成“酶-DNA“共價中間物DNA連接。不需輔助因因子。B.DNA旋轉酶(DNAgyrase)：拓撲異構酶II，引入DNA分子負超螺旋旋。需要ATP。DNA拓撲異構酶(Topisomerase)4引物酶(Primase)DNA的復制需要RNA引物。E.coli引物酶由dnaG基因編碼，60KD，單細胞50-100個分子。在某些單鏈噬噬菌體和質粒粒DNA復制時，引物物的合成是由由RNA聚合酶催化的的。引物酶與一般般RNA聚合酶的區(qū)別別：（1）對雷米封不不敏感，而RNA聚合酶則敏感感；（2）可以利用核核糖核苷酸和和脫氧核糖核核苷酸兩種底底物；（3）只在復制起起點處合成RNA引物而引發(fā)DNA的復制。5DNA聚合酶(DNAPolymerase,DNAPol)基本特性：（1）以dNTP為底物催化合合成DNA；（2）需要模板和和引物；（3）DNA合成的方向是是5‘3’。109kD多肽，每個細細胞有約400分子。模板專一性和和底物專一性性均較差。除了聚合酶活活性外，DNAPolI酶還具具有：（1）3‘→→5’外切酶酶活性（2）5‘→3’外切酶活性DNA聚合酶活性和和5‘→3’外切酶活性協(xié)協(xié)同作用，可可以進行缺口口平移(Nicktranslation)。A．E.coliDNA聚合酶I(DNApolI)120kD，每個細胞約約有100個酶分子，活活性為DNAPolI的5%。催化特性：(1)補平作用：最最適模板為雙雙鏈DNA中間有空隙的的單鏈DNA部分；(2)具有3'→5'外切酶活性，，但無5'→3'外切酶活性。。(3)可能能在DNA的損傷修復中有一定作用用。B．E.coliDNA聚合酶II(DNApolII)DNA復制所必需的的酶；多種亞亞基，每個細細胞中10-20個分子。具有3‘→5’和5‘→3’外切酶活性。。3‘→5’外切酶活性的的最適底物是是單鏈是DNA；5'→3'外切酶活性要要求有單鏈DNA為起始作用底底物，但一旦旦開始后，便便可作用于雙雙鏈區(qū)。C．E.coliDNA聚合酶III(DNApolIII)功能polⅠpolⅡpolⅢ聚合作用5'→3'+

+外切酶活性3'→5'+++外切酶活性5'→3'+++模板及引物的選擇

完整的DNA雙鏈－－－帶引物的長單鏈DNA+－－帶缺口的雙鏈DNA+－－雙鏈而有間障的DNA+++一般性質

分子量109kD120kD＞140kD每細胞中的分子量40017-10010-20結構基因polApolBpolC(1)DNA聚合酶酶a，300kD，4或5個亞基組成，，占總量的80-90%，主要負責染染色體DNA的復制。(2)DNA聚合酶b，45kD，單鏈，主要要修復核內(nèi)DNA。D．真核生物的DNA聚合酶(3)DNA聚合酶g，140kD，負責線粒體體DNA的復制。(4)DNA聚合酶δ，與原核生物物的聚合酶類類似，具有3‘→5’核酸外切酶活活性。除了DNA聚合酶δ，其它DNA聚合酶均沒有有3'→5'或5'→3'外切酶活性。。DNApolymerasesinhumanandSV406DNA連接酶(DNAlygase)催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯酯鍵。(1)大腸桿桿菌的的DNA連接酶酶75kD，對胰胰蛋白白酶敏敏感，，每個個細胞胞中約約有300個分子子。在在DNA復制、、修復復和重重組中中起著著重要要的作作用。。(2)噬菌體體T4DNA連接酶酶60kD，需要要ATP。可連接接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈鏈DNA粘性末末端或或平頭頭末端端。A．原核生物物真核生生物DNA連接酶酶有兩兩型，，連接接酶I和II。需要要ATP參與提提供能能量。。DNA連接酶酶I約為200kD，主要要存在在于生生長旺旺盛細細胞中中；DNA連接酶酶II約85kD，主要要存在在于生生長于于不活活躍的的細胞胞(restingcell)中。B．真核生物物DNA連接酶五、DNA復制過過程1復制的的引發(fā)發(fā)(Priming)包括DNA復制制起點點雙鏈鏈打開開，RNA引物物的合合成，，DNA聚聚合酶酶聚合合反應應開始始進行行。轉錄激激活(transcriptionalactivation)：RNA聚合酶酶沿后后續(xù)鏈鏈模板板轉錄錄一短短的RNA分子子，分分開DNA雙鏈鏈；特特定序序列與與引發(fā)發(fā)體結結合，，并在在前導導鏈模模板DNA上開始始合成成RNA引物的的過程程。前導鏈鏈(leadingstrand)的復制制引發(fā)發(fā)過程程中還還需要要其他他一些些蛋白白質參參與，，如大大腸桿桿菌的的dnaA蛋白。。五、DNA復制過過程1復制的的引發(fā)發(fā)(Priming)包括DNA復制制起點點雙鏈鏈打開開，RNA引物物的合合成，，DNA聚聚合酶酶聚合合反應應開始始進行行。轉錄激激活(transcriptionalactivation)：：RNA聚合酶酶沿后后續(xù)鏈鏈模板板轉錄錄一短短的RNA分子子，分分開DNA雙鏈鏈；特特定序序列與與引發(fā)發(fā)體結結合，，并在在前導導鏈模模板DNA上開始始合成成RNA引物的的過程程。RNA引物可可能與與減少少DNA復制起起始處處的突突變有有關。。引發(fā)過過程：：DNA螺旋酶酶首先先在復復制起起點處處將雙雙鏈DNA解開合成RNA引物分分子，，分開開雙鏈鏈DNA鏈單鏈DNA結合蛋蛋白(SSB)結合在在被解解開的的鏈上上復制因因子X(n蛋白)，復制制因子子Y(n‘蛋白)，n“蛋白，，i蛋白，，dnaB蛋白和和dnaC蛋白等等6種蛋白白質組組成的的引發(fā)發(fā)前體體(preprimosome)，與單單鏈DNA結合生生成中中間物物引發(fā)前前體與與引物物酶(primase)組裝成成引發(fā)發(fā)體(primosome)引發(fā)體體在單單鏈DNA上移動動，在在dnaB亞基的的作用用下識識別DNA復制起起點位位置引發(fā)體體首先先在前前導鏈鏈上合合成RNA引物，，然后后在后后續(xù)鏈鏈上沿沿5‘→→3’’方向不不停的的移動動，在在一定定距離離上反反復合合成RNA引物。。DNA復制的的延伸伸由DNA聚合酶酶III催催化正超螺螺旋的的解除除（1）DNA解鏈而而產(chǎn)生生正超超螺旋旋可以以被原原來存存在的的負超超螺旋旋所中中和；；（2）DNA拓撲異異構酶酶I可以打打開一一條鏈鏈，使使正超超螺旋旋狀態(tài)態(tài)轉變變成松松弛狀狀態(tài)；；而DNA拓撲異異構酶酶II（旋轉轉酶））可以以在DNA解鏈前前方不不停地地繼續(xù)續(xù)將負負超螺螺旋引引入雙雙鏈DNA。這兩兩種機機制保保證了了無論論是環(huán)環(huán)狀DNA還是開開環(huán)DNA的復制制順利利的解解鏈。。DNA生長鏈鏈的延延伸主主要由由DNA聚合酶酶III催化，，由7種多肽肽組成成。全全酶中中所有有亞基基對完完成DNA復制制都都是是必必需需的的。。α亞基基具具有有聚聚合合功功能能和和5'→→3'外切切酶酶活活性性，，ε亞基基具具有有3'→→5'外切切酶酶活活性性。。另另外外，，全全酶酶中中還還有有ATP分子子它它是是DNA聚合合酶酶Ⅲ催化化第第一一個個脫脫氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸連連接接在在RNA引物物上上所所必必需需的的，，其其他他亞亞基基的的功功能能尚尚不不清清楚楚。。在DNA復復制制叉叉處處要要能能由由兩兩套套DNA聚聚合合酶酶III在在同同一一時時間間分分別別進進行行復復制制DNA前前導導鏈鏈和和后后續(xù)續(xù)鏈鏈。。如如果果后后續(xù)續(xù)鏈鏈模模板板環(huán)環(huán)繞繞DNA聚聚合合酶酶III全全酶酶，，并并通通過過DNA聚聚合合酶酶III，，然然后后再再折折向向與與未未解解鏈鏈的的雙雙鏈鏈DNA在在同同一一方方向向上上，，則則后后續(xù)續(xù)鏈鏈的的合合成成可可以以和和前前導導鏈鏈的的合合成成在在同同一一方方向向上上進進行行。。當DNA聚合酶III沿著后續(xù)鏈模模板移動時，，遇到RNA引物后就開始始延伸合成。。到達前一岡岡崎片段時停停止。復制叉叉繼續(xù)向前運運動，產(chǎn)生了了又一后續(xù)鏈鏈岡崎片段。。DNA復制體(replisome)：在復制叉叉附近，形形成了以兩兩套DNA聚合酶III全酶分子、、引發(fā)體和和螺旋構成成的類似核核糖體大小小的復合體體。復制體體在DNA前導鏈模板板和后續(xù)鏈鏈模板上移移動時便合合成了連續(xù)續(xù)的DNA前導鏈和由由許多岡崎崎片段組成成的后續(xù)鏈鏈。在DNA合成延伸過過程中主要要是DNA聚合酶III的作用。當當岡崎片段段形成后，，DNA聚合酶I通過其5'→3'外切酶活性性切除岡崎崎片段上的的RNA引物，同時時，利用后后一個岡崎崎片段作為為引物由5'→3'合成DNA。最后兩個個岡崎片段段由DNA連接酶將其其接起來，，形成完整整的DNA后續(xù)鏈。DNA復制的終止止DNA上也存在著著復制終止止位點，DNA復制制將在復制制終止位點點處終止，，并不一定定等全部DNA合成成完畢。當當RNA引引物被切除除后，中間間所遺留的的間隙由DNA聚合合I所填充充。但目前前對復制終終止位點的的結構和功功能了解甚甚少。線性性DNA分分子兩端是是靠端粒酶酶完成其復復制。六、DNA復制的真實實性大腸桿菌中中，每復制制109-1010個核苷酸便便要出現(xiàn)一一個誤差。。每1000個細胞胞經(jīng)過一次次分裂才會會插入一個個不正常的的核苷酸。。如果單純純靠堿基對對原則來維維持其DNA復制準準確性的話話，那么誤誤差出現(xiàn)的的頻率將為為10-4-10-5。因而，在在細胞內(nèi)除除了堿基對對原則外，，必然還有有其他因子子的作用，，來維持DNA復制制的準確性性。DNA聚合酶本身身具有校對對作用按堿基配對對原則，錯錯誤核苷酸酸摻入的機機率為10-4-10-5，然后，DNA聚合酶本身身的校對作作用又可以以使錯誤核核苷酸摻入入的機率為為10-4-10-5。這樣，每每摻入一個個核苷酸，，發(fā)生錯誤誤的機會只只有10-8-10-10。引物RNA的切除DNA復制開始時時摻入的核核苷酸往往往容易出錯錯。RNA引物可以被被切除，不不會影響DNA的準確性。。真核生物DNA聚合酶無3'→5'外切酶活性性。因此，，可能存在在其他校正正機制以保保證DNA復制的準確確性。七、環(huán)狀DNA的復制的方方式1．θ型復制環(huán)狀DNA可以采取取上述典型型的DNA復制方式式進行復制制，即從復復制起點開開始，雙向向同時進行行，形成θ樣中間物，，故又稱"θ"型復制，最最后兩個復復制方向相相遇而終止止復制。2．D環(huán)復制(D-loop)線粒體DNA的復制屬于于D環(huán)復制，即即兩條鏈的的復制不是是同步的。。（1）H鏈首先合成成：在復制制起點處以以L鏈為模板，，合成─RNA引物，然后后由DNA聚合酶γ催化合成一一個500-600bp長的H鏈片段。該該片段與L鏈以氫鍵結結合，將親親代的H鏈置換出來來，產(chǎn)生一一種D環(huán)復制中間間物。（2）H鏈片段的繼繼續(xù)合成：：上述產(chǎn)生生的H鏈片段由于于太短而很很容易被擠擠出去恢復復線粒體DNA完整的雙螺螺旋結構。。但有時這這個片段會會繼續(xù)合成成，這需要要依靠拓撲撲異構酶和和螺旋酶的的作用將雙雙鏈打開。。（3）L鏈合成開始始：以被置置換下來的的親代H鏈為模板開開始合成L鏈DNA，合成也需需要RNA引物物。。（4））復復制制的的完完成成：：H鏈鏈的的合合成成提提前前完完成成，，L鏈鏈的的合合成成隨隨后后結結束束。。線線粒粒體體DNA合成成速速度度相相當當緩緩慢慢，，約約每每秒秒10個核核苷苷酸酸，，整整個個復復制制過過程程需需要要1個小小時時。。剛剛剛剛合合成成的的線線粒粒體體DNA是松松弛弛型型的的，，需需要要40分鐘鐘將將其其變變成成超超螺螺旋旋型型。。2．滾滾環(huán)環(huán)復復制制(Rollingcircle)親代代雙雙鏈鏈DNA的一一條條鏈鏈在在DNA復制制起起點點處處被被切切開開，，其其5‘端游離離出來來并且且很快快被單單鏈結結合蛋蛋白結結合。。同時時環(huán)狀狀雙鏈鏈DNA環(huán)繞其其軸不不斷的的旋轉轉，而而且以以3’-OH端為引引物的的DNA生長鏈鏈則不不斷地地以另另一條條環(huán)狀狀DNA鏈為模模板向向前延延伸。。在DNA解鏈時時不會會產(chǎn)生生超螺螺旋。。當5'-端從環(huán)環(huán)上解解下來來后不不久，，即與與單鏈鏈結合合蛋白白結合合，以以后可可移動動的引引發(fā)體體便在在其上上形成成，以以引發(fā)發(fā)RNA引物的的合成成，然然后由由DNA聚合酶酶III催化合合成岡岡崎片片段。。DNA的延伸伸可以以一直直進行行下去去，產(chǎn)產(chǎn)生的的DNA鏈可以以是親親代DNA單位長長度的的許多多倍。。八、不不需要要RNA引物的的DNA復制部分線線性DNA病毒的的復制制不需需要RNA引物。。復制從從DNA的任何何一端端開始始。只只能利利用一一條DNA鏈作為為模板板，即即以3‘→→5’’鏈為模模板。。另一條條非模模板DNA鏈自身身的5‘和3’可以互互補配配對，，然后后在3‘端開始始以此此鏈為為模板板重新新合成成另一一條子子鏈。。八、不不需要要RNA引物的的DNA復制所有的的腺病病毒DNA生長鏈鏈上都都有一一個特特異的的蛋白白質分分子附附著在在其5'末端的的胞嘧嘧啶核核苷酸酸上。。在DNA復制開開始之之前，，該末末端蛋蛋白質質通過過共價價鍵與與dCMP的5'磷酸基基相連連。胞胞嘧啶啶通過過堿基基配對對與腺腺病毒毒DNA模板3'末端的的鳥嘌嘌呤核核苷酸酸配對對結合合，然然后由由病毒毒本身身編碼碼的DNA聚合酶酶以此此末端端蛋白白-dCMP復合物物為引引物連連續(xù)合合成腺腺病毒毒整個個基因因組的的36000個核苷苷酸。。九、DNA的修復復(DNArepairing)回復修修復一般能能夠將將DNA修復到到原樣樣。光修復復由細菌菌中的的DNA光解酶酶（photolyase）完成成，此此酶能能特異異性識識別紫紫外線線造成成的核核酸鏈鏈上相相鄰嘧嘧啶共共價結結合的的二聚聚體，，并與與其結結合，，這步步反應應不需需要光光；結結合后后如受受300-600nm波長的的光照照射，，則此此酶就就被激激活，，將二二聚體體分解解為兩兩個正正常的的嘧啶啶單體體，然然后酶酶從DNA鏈上釋釋放，，DNA恢復正正常結結構。。單鏈斷斷裂的的重接接部分可可僅由由DNA連接酶酶（ligase）參與與而完完全修修復。。雙鏈鏈斷裂裂缺幾幾乎不不能修修復。。堿基的的直接接插入入DNA鏈上嘌嘌呤的的脫落落造成成無嘌嘌呤位位點，，能被被DNA嘌呤插插入酶酶（insertase）識別別結合合，在在K+存在的的條件件下，，催化化游離離嘌呤呤或脫脫氧嘌嘌呤核核苷插插入生生成糖糖苷鍵鍵，且且催化化插入入的堿堿基有有高度度專一一性、、與另另一條條鏈上上的堿堿基嚴嚴格配配對，，使DNA完全恢恢復。。烷基的的轉移移O6甲基鳥鳥嘌呤呤甲基基轉移移酶，，能直直接將將甲基基從DNA鏈鳥嘌嘌呤O6位上的的甲基基移到到蛋白白質的的半胱胱氨酸酸殘基基上而而修復復損傷傷的DNA。切除修修復（（excisionrepair）修復過過程需需要多多種酶酶的一一系列列作用用首先由由核酸酸酶識識別DNA的損傷傷位點點，切切開磷磷酸二二酯鍵鍵。由5’——3’’核