高效液相色譜法教學(xué)

關(guān)于高效液相色譜法教學(xué)第1頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六前言:

HPLC是70年代以后發(fā)展最快的一個(gè)分析化學(xué)分支，現(xiàn)已成為生化、醫(yī)學(xué)、藥物、化學(xué)化工、食品衛(wèi)生、環(huán)保檢測(cè)等領(lǐng)域最常用的分離分析手段。第2頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六我國(guó)：

開(kāi)始僅為少數(shù)研究實(shí)驗(yàn)室擁有，現(xiàn)很多的生產(chǎn)、研究、質(zhì)檢部門(mén)都擁有。廣泛應(yīng)用于：質(zhì)量控制、分析化驗(yàn)、制備分離。

講課目的：入門(mén)

教材：《實(shí)用色譜法》（詹益興編著）

學(xué)習(xí)要求：記好筆記，以課堂教學(xué)內(nèi)容為主。第3頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六課時(shí)安排：第一章：高效液相色譜的基本原理4學(xué)時(shí)第二章：高效液相色譜的儀器裝置2學(xué)時(shí)第三章：液固、鍵合相色譜3學(xué)時(shí)第四章：離子交換色譜和離子對(duì)色譜3學(xué)時(shí)第五章：凝膠滲透色譜1學(xué)時(shí)第六章：實(shí)驗(yàn)技術(shù)和輔助實(shí)驗(yàn)技術(shù)1學(xué)時(shí)復(fù)習(xí)1學(xué)時(shí)第4頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六參考書(shū)籍：1.色譜理論基礎(chǔ)（盧佩章、戴朝政編）2.高效液相色譜法（鄒漢法、張玉奎、盧佩章編著）3.高效液相色譜方法及應(yīng)用（色譜技術(shù)叢書(shū)、化學(xué)工業(yè)出版社、于世林編著)第5頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§1－1概述

一、色譜法

混合物最有效的分離、分析方法。是一種分離技術(shù)?；旌衔锓蛛x過(guò)程：試樣中各組分在固液兩相間不斷進(jìn)行著的分配。一相固定不動(dòng)，稱(chēng)為固定相。另一相是攜帶試樣混合物流過(guò)固定相的液體，稱(chēng)為流動(dòng)相。第一章高效液相色譜法基本原理第6頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六液相色譜儀第7頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六高效液相色譜儀流程圖第8頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六二、色譜法原理混合物中各組份在不互溶的兩相中溶解、吸附等化學(xué)性能存在差異；當(dāng)兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),各組分在兩相中反復(fù)多次進(jìn)行平衡分配而達(dá)到相互分離。第9頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六分離原理:分離是一個(gè)物理過(guò)程。固定相(StationaryPhase)流動(dòng)相(MobilePhase)進(jìn)樣(Injection)洗脫(Elution)相互作用(Interaction)第10頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六三、高效液相色譜法的特點(diǎn)高壓:

以液體作為流動(dòng)相，液體流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到阻力較大必須對(duì)流動(dòng)相施加高壓。一般可達(dá)到150～300kg／cm2，甚至可達(dá)700kg／cm2以上。第11頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六高速:

分析時(shí)間較經(jīng)典液相色譜少得多（交換速度快），一個(gè)復(fù)雜樣品的分析僅需幾分鐘到幾十分鐘。

高效:氣相色譜的分離效能很高，高效液相色譜的柱效則更高（化學(xué)鍵合相），一般約可達(dá)

6000理論塔板／米第12頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六高靈敏度

①紫外檢測(cè)器的最小檢測(cè)量可達(dá)(10-9g)；熒光檢測(cè)器的靈敏度可達(dá)（10-11g）。②所需試樣很少；微升數(shù)量級(jí)高選擇性可分離不同類(lèi)型化合物和異構(gòu)體，也可分析在性質(zhì)上極為相似的化合物(同位素、同分異構(gòu)體、空間異構(gòu)體、手性化合物）

第13頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六高效液相色譜法的特性:高壓、高效、高速、高靈敏。適用：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定樣品

第14頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六四、HPLC與GC區(qū)別

1．分析對(duì)象的區(qū)別

GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點(diǎn)低的樣品，占有機(jī)物的20%HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品.對(duì)分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差樣品均可檢測(cè)。

占有機(jī)物的80%第15頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六2．流動(dòng)相的區(qū)別GC：流動(dòng)相為惰性，組分與流動(dòng)相無(wú)相互作用力，只與固定相有相互作用。HPLC：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分間有相互作用力，參與和影響色譜分離.

對(duì)分離起主要作用。3．操作條件差別GC：加溫操作HPLC：室溫；高壓說(shuō)明：氣相、液相地位同樣重要

兩種互補(bǔ)不足的色譜方法

靈敏度：氣相﹥液相應(yīng)用范圍：液相﹥氣相第16頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六五、色譜法的分類(lèi)吸附色譜(AbsorptionChromatography)組分對(duì)固定相表面吸附力的不同而分離分配色譜(PartitionChromatography)組分在固定相和流動(dòng)相中的溶解度不同而分離離子交換色譜(IonExchangeChromatography)組份離子交換親和力的差異而分離體積排除色譜(SizeExclusionChromatography)組分分子量大小不同,對(duì)固定相的滲透力不同而分離第17頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§１－２基本概念一、色譜圖

記錄儀所記錄的濃度對(duì)分離時(shí)間的函數(shù)，稱(chēng)為色譜圖。第18頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六色譜過(guò)程特點(diǎn)：①濃度對(duì)分離時(shí)間呈高斯曲線型②色譜條件一定時(shí)，各組分都有一特定時(shí)間在圖譜中出現(xiàn)，稱(chēng)為組分的保留時(shí)間。③柱效一定時(shí)，組分保留值越小，峰越窄；保留值越大，峰越寬。④相鄰峰的保留時(shí)間相差越大，越易分離。第19頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六二、色譜參數(shù)

1.保留時(shí)間-tR從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時(shí)間，用tR表示。第20頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六2.分配系數(shù)K在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比（單位：g/mL），稱(chēng)為分配系數(shù)K分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。K值小，先流出柱子；K值大，保留作用強(qiáng)，后流出柱子。第21頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分分配系數(shù)K越大，出峰越慢；每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；各組分有不同K值是分離的基礎(chǔ)（差移速度）某組分的K=0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。第22頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六3.容量因子k’(capacityfactor)

一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比。

1.Ｋ與k’都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù),隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化2.容量因子可以由實(shí)驗(yàn)測(cè)得。3.色譜的保留作用：組分理化性質(zhì)不同→兩相間分配量不同→柱內(nèi)保留時(shí)間不同第23頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六4.容量因子與保留時(shí)間的關(guān)系k’太小---沒(méi)有充分利用填料的分離能力k’太大---分析時(shí)間太長(zhǎng)k’范圍：１～１０k’∝1/ε0（ε0溶劑強(qiáng)度——使組分遷移快慢的能力）P310表3-10tR=to(1+k’)第24頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六5.選擇性系數(shù)α

可用來(lái)衡量?jī)晌镔|(zhì)的分離程度，用α表示。第25頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六色譜理論需要解決的問(wèn)題？

色譜分離過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間：色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素控制；（組分和固定相的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素控制；（兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論。第26頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§1-3色譜柱的分離效率一、塔板理論

塔板理論認(rèn)為:一根柱子可以分為n段，每段內(nèi)組分在兩相間迅速達(dá)到平衡，把每一段稱(chēng)為一塊理論塔板。設(shè)柱長(zhǎng)為L(zhǎng)，理論塔板高度為H，則

H=L/ＮＮ為理論塔板數(shù)。第27頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

理論塔板數(shù)一N①色譜峰對(duì)稱(chēng)：

說(shuō)明：a.

在給定的操作條件下，N幾乎相同b.N為常量時(shí)，tw隨tR成正比例變化c.與柱長(zhǎng)有關(guān):比較不同長(zhǎng)度色譜柱的柱效時(shí)，應(yīng)當(dāng)比較它們?cè)谙嗤L(zhǎng)下的N值。例d.是一種理想狀態(tài)第28頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

②有拖尾峰時(shí):可用半峰寬來(lái)表示N：

N＝5．54(tR/W1/2)2W1/2-----半峰寬例：測(cè)得tR=105mm、W1/2

=4mm，求得N=3789，若此柱長(zhǎng)為250mm,折成每米的理論塔板數(shù)約為15200.

第29頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六理論塔板高度H物理意義：組分在兩相間達(dá)到一次平衡對(duì)應(yīng)的柱長(zhǎng)H愈小→組分在兩相間平衡分配次數(shù)越多→柱效↑（不能說(shuō)明分離一定實(shí)現(xiàn)）第30頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六說(shuō)明：①Ｎ大，固定相分離潛能大。

（分離與否，還取決于其他色譜條件）②一定色譜條件下，對(duì)k’有差異的組分，則柱效愈高，分離效果愈好。第31頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六塔板理論的特點(diǎn)和不足：(1)當(dāng)L一定時(shí)，N越大(H越小)，被測(cè)組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效越高，所得色譜峰越窄。(2)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果：如兩組分的分配系數(shù)K相同，無(wú)論該色譜柱的柱效多大，都無(wú)法分離。第32頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六(3)塔板理論無(wú)法解釋同一色譜柱在不同的流動(dòng)相流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無(wú)法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。第33頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六二.峰擴(kuò)展和速率方程式1.峰擴(kuò)展--由于柱內(nèi)柱外各種因素引起的色譜峰變寬或變形，從而造成色譜柱效的降低峰擴(kuò)展程度：取決于組分在柱內(nèi)的平衡分配次數(shù)例：引起峰擴(kuò)展因素：柱內(nèi)、柱外第34頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六2.速率方程式（范·弟姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，u：流動(dòng)相流速(cm/s)。減小A、B、C三項(xiàng)可提高柱效。

A，B，C三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？第35頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六A─渦流擴(kuò)散項(xiàng)

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充得越均勻，A↓，H↓，柱效Ｎ↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。第36頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六B/u—分子擴(kuò)散項(xiàng)

B=2υD

D：試樣組分分子的擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;(2)擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(Ｎ↓)，分離變差;(3)B/u與流速有關(guān)：流速↓→滯留時(shí)間↑→擴(kuò)散↑(＞0.5ml/min)(4)擴(kuò)散系數(shù)D，Ｄ↓→B值↓。

液相中，分子擴(kuò)散可忽略第37頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六C·u—傳質(zhì)項(xiàng)

傳質(zhì)—溶質(zhì)分子在兩相間濃度不同，由濃度高的相不斷遷移至濃度低的相，直到濃度達(dá)到平衡。根據(jù)傳質(zhì)形式分：固定相傳質(zhì)移動(dòng)相傳質(zhì)

C=（Cs+Cm）

第38頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六固定相傳質(zhì)原因：進(jìn)出固定相速度不同（固相，液相）減小措施：①使用薄的固定相層②小顆粒填料移動(dòng)相傳質(zhì)原因：遷移滯留減小措施①填裝均勻緊密②使用小顆粒填料和表面多孔性填料第39頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第40頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六3.速率理論的要點(diǎn):(1)柱內(nèi)的峰擴(kuò)展與渦流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散、傳質(zhì)阻力有關(guān)。(2)通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、液膜厚度及流?dòng)相流速可提高柱效。第41頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六(3)為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和填料對(duì)柱效及分離的影響。

選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。第42頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六4.獲得高柱效的幾種方法：①選用細(xì)的顆粒填料②流動(dòng)相流速低③流動(dòng)相粘度?、苌邷囟娶萑苜|(zhì)擴(kuò)散系數(shù)與其結(jié)構(gòu)有關(guān)ⅰ大分子，擴(kuò)散系數(shù)?、⑿》肿?，擴(kuò)散系數(shù)大第43頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六5.影響分離的因素與提高柱效的途徑

液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬(wàn)分之一，在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u較小，可忽略不計(jì)，即H=A+Cu

降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。氣相和液相Ｈ－ｕ區(qū)別第44頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§１－４分離度(Rs)

色譜分離目的：----------合理的時(shí)間內(nèi)將樣品中組分成功分離分離度：表示分離狀況的一種度量分離度影響因素：保留值之差──色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素；峰的寬度──色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素。第45頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六討論：

色譜分離中的四種情況：①柱效較高，ΔK(分配系數(shù))較大，完全分離。②ΔK

不是很大，柱效較高，峰較窄，基本分離。③柱效較低，ΔK

較大，但分離的不好。④ΔK

小，柱效低，分離效果更差。第46頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第47頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六一．分離度的數(shù)學(xué)表達(dá)式：Rｓ=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%；Rｓ=1：分離程度98%(達(dá)到定性定量分析的最低要求)Rｓ=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰達(dá)到基線分離）。第48頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六對(duì)濃度不同組分而言：兩個(gè)組分的分離度會(huì)隨濃度比的增大而減小例：對(duì)多組分而言：整個(gè)色譜分離的分離度取決于Rs最小值的兩個(gè)峰。第49頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六二．分離度影響因素①峰的寬度（峰寬越小，Rs越大）峰的寬窄主要反映了色譜分離的動(dòng)力學(xué)特性②兩峰的保留時(shí)間之差（△tR越大，Rs越大）反映了色譜分離的熱力學(xué)特性分離度基本關(guān)系式：第50頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六四．控制分離度方法

①改變k’調(diào)節(jié)溶劑強(qiáng)度可以改變k’增大ｋ’---使用較弱溶劑降低ｋ’---使用較強(qiáng)溶劑正相色譜---固定相極性大于移動(dòng)相（溶劑極性大→溶劑強(qiáng)度大→洗脫能力強(qiáng)→ｋ’?。┓聪嗌V---固定相極性小于移動(dòng)相（溶劑極性大→溶劑強(qiáng)度小→洗脫能力弱→ｋ’大）P307~311第51頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六例:流動(dòng)相極性變化對(duì)組分k’的影響第52頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六②更換色譜柱（改變N）

措施：a.選擇長(zhǎng)柱子(N=L/H)b.填料顆粒盡量小c.低流速(溶質(zhì)傳質(zhì)阻力小，峰擴(kuò)展小)d.低的溶劑粘度(提高柱效)e.提高柱溫第53頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六③改變選擇性系數(shù)

（α

=1，不能實(shí)現(xiàn)分離)下列途徑改善：a.流動(dòng)相梯度洗脫—洗脫過(guò)程中，流動(dòng)相組成隨時(shí)間的變化而變化P279（適用于極性范圍寬的樣品）b.固定相(換柱，改變填料）c.溫度（改變熱力學(xué)參數(shù)）第54頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六五.分離度控制的一般原則:①開(kāi)始k’值很小，若要增大Rs，則首先應(yīng)將k’調(diào)整至1＜k’＜10范圍，這樣，不用改變其他條件，就可使Rs增大。②開(kāi)始k’已在1＜k’＜10范圍，但Rs不大，則必須增大N來(lái)改善Rs。③k’，N的改變都不能增大Rs時(shí)，再設(shè)法改變?chǔ)恋?5頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第二章儀器裝置

四大部件：高壓輸液泵進(jìn)樣器高效分離柱檢測(cè)器

第56頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§2－1高壓輸液泵作用：向色譜柱輸送一個(gè)連續(xù)、恒定的移動(dòng)相。一、對(duì)泵系統(tǒng)的要求1.使用方便（易調(diào)節(jié)流量、過(guò)壓保護(hù)等）2.更換洗脫液容易、死體積小3.有最大工作壓力(20MPa，130MPa)4.一定流量范圍（直徑小，流量小；速度快，流量大。）（0.1~10ml/min)5.流量穩(wěn)定性好(流量噪聲、流量波動(dòng)、流量漂移）6.流量精度高第57頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六機(jī)械往復(fù)式柱塞泵的工作原理：第58頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六特點(diǎn)：①能連續(xù)供給恒定體積的移動(dòng)相，不受整個(gè)色譜系統(tǒng)中其余部分稍有變化的影響。②死體積較小，約0.1ml，更換溶劑方便，適用于梯度洗脫。缺點(diǎn)：輸出有脈沖波動(dòng)二個(gè)因素：①脫氣不完全②泵的周期性吸液影響檢測(cè)靈敏度。（對(duì)紫外檢測(cè)器影響不大）第59頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第60頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六泵系統(tǒng)發(fā)展趨勢(shì)①高效：填料顆粒↓→分離效率↑→柱壓降↑→泵的工作壓力↑②分析時(shí)間短：更快流速→柱壓降↑

(超快速分析）③減少洗脫液用量(4.6mm→1mm，流量減少20倍)④液相色譜的多元洗脫系統(tǒng)P277～280第61頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§2－2

色譜柱組成：精密管徑的不銹鋼管、填料、柱接頭要求：①柱管內(nèi)壁非常光滑②柱接頭設(shè)計(jì)要保證系統(tǒng)中引入最小死體積（柱前、柱后）③能密封高壓液體④兩端加過(guò)濾片第62頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

柱體為直形不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。減小填料粒度和柱徑以提高柱效。第63頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六柱效的影響因素①填料的顆粒度及其均勻性②柱長(zhǎng)、填裝的方法與技巧常用：內(nèi)徑2－5mm（4.6mm)柱效一定時(shí)，柱長(zhǎng)與顆粒度成正比例如：顆粒度5～10um、柱長(zhǎng)15～30cm顆粒度3～5um、柱長(zhǎng)7.5～15cmP282～283第64頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§2－3進(jìn)樣裝置

六通進(jìn)樣閥P280～281結(jié)構(gòu)如圖：第65頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§2-4檢測(cè)系統(tǒng)功能：連續(xù)地將色譜柱中流出的組分隨時(shí)間變化的情況，轉(zhuǎn)變成大小不同的電信號(hào)輸入到記錄儀中，得到色譜圖。按檢測(cè)方式不同，分為：①總體性質(zhì)檢測(cè)器（通用型）

示差折射檢測(cè)器②溶質(zhì)性質(zhì)檢測(cè)器（選擇型）

紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器第66頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六檢測(cè)器的性能指標(biāo)一個(gè)理想檢測(cè)器，必須具備下列條件：①靈敏度高②不受溫度及流動(dòng)相流速變化的影響③響應(yīng)隨組分量的變化而線性地變化④穩(wěn)定性好，操作方便第67頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六衡量指標(biāo)：①靈敏度S=△R/△Q②噪音－在沒(méi)有樣品情況下，檢測(cè)器輸出的最大振幅（溫度、流量、泵）③漂移－檢測(cè)器在一段時(shí)間內(nèi)，基線隨時(shí)間的增加而產(chǎn)生的偏離（電壓、流動(dòng)相）④最小檢測(cè)限－樣品產(chǎn)生兩倍于噪音信號(hào)時(shí)的（檢測(cè)下限）濃度⑤線性范圍－檢測(cè)信號(hào)呈線性變化時(shí)，最大和最小進(jìn)樣量之比第68頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六檢測(cè)器

紫外檢測(cè)器（光電二極管陣列檢測(cè)器）示差折光檢測(cè)器

熒光檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器

第69頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

a.紫外檢測(cè)器

應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：靈敏度高；線性范圍寬；流通池可做得很小(1mm×10mm，容積8μL)；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作(波長(zhǎng)范圍，常用波長(zhǎng)）

200～400nm

254nm、280nm可用于梯度洗脫。

第70頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六b.光電二極管陣列檢測(cè)器

紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。第71頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六光電二極管陣列檢測(cè)器第72頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六三維：光譜-色譜圖第73頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六檢測(cè)原理比爾定律：A=εcL紫外檢測(cè)器優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高（10－10g/ml)②對(duì)梯度洗脫是一種理想檢測(cè)器局限性：①不能檢測(cè)對(duì)紫外光沒(méi)有吸收的樣品②不能使用對(duì)紫外光有吸收的溶劑P289～293第74頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第三章液固色譜和鍵合相色譜§3－1液固吸附色譜一、原理:固定相是極性吸附劑，不同組份官能團(tuán)具有不同極性，因而對(duì)固定相的吸附能力不同。極性越大，吸附能力越強(qiáng)；極性越低，吸附能力越弱而導(dǎo)致分離。Flow流動(dòng)相活性吸附點(diǎn)固定相第75頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六存在競(jìng)爭(zhēng)吸附：吸附－解吸平衡①溶質(zhì)、流動(dòng)相分子之間②溶質(zhì)中不同官能團(tuán)之間

競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，導(dǎo)致了分離。溶質(zhì)在柱內(nèi)受到兩種力作用：①固定相的吸附力②流動(dòng)相的溶解力當(dāng)吸附力﹥?nèi)芙饬’大吸附力﹤?cè)芙饬’小第76頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六二．分離對(duì)象：①官能團(tuán)有差別的不同類(lèi)型化合物

（烷基類(lèi)吸附弱，不能分離）②幾何異構(gòu)體(固定相表面是剛性結(jié)構(gòu)溶質(zhì)分子官能團(tuán)與吸附中心的相互作用隨分子的幾何形狀而改變）第77頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六三．填料的類(lèi)型及其選擇①按形狀分：a.球形b.無(wú)定形②按多孔程度分：a.多孔型b.薄殼型③按極性分：a.極性（硅膠、Al2O3、MgO、分子篩）b.非極性（活性碳）

第78頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六四、硅膠的活性控制及標(biāo)準(zhǔn)化硅膠的特點(diǎn)：活性控制意義：標(biāo)準(zhǔn)化方法：市售未處理硅膠→加熱4－6小時(shí)，活化去水，再加進(jìn)定量水分，使吸附劑含水量保持恒定。（100m2表面積含水0.02～0.03g為佳）第79頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六吸附強(qiáng)度分類(lèi)根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)類(lèi)型，可將它們?cè)诠枘z上的吸附強(qiáng)度排序：P315歸納：①官能團(tuán)不同→極性不同→吸附強(qiáng)度不同②幾何異構(gòu)體→空間位置不同→吸附強(qiáng)度不同P314-316P331-333第80頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六分子空間效應(yīng)。與官能團(tuán)相鄰的大烷基可能降低保留能力；（位阻效應(yīng)）順式化合物的保留能力可能比反式化合物強(qiáng)；對(duì)位化合物的保留能力可能比鄰位化合物強(qiáng)。

第81頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六五．樣品分子結(jié)構(gòu)對(duì)保留的影響

對(duì)吸附色譜來(lái)說(shuō),主要取決于樣品分子所含的官能團(tuán)的類(lèi)型及其數(shù)目。常見(jiàn)官能團(tuán)的吸附強(qiáng)度：●不吸附：烷烴●弱吸附：烯烴、硫醇、硫醚、單環(huán)或雙環(huán)芳烴、鹵代芳烴●中等吸附：多環(huán)芳烴、醚、腈、硝基物、大多數(shù)羰基化合物●強(qiáng)吸附：醇、酚、胺、酰胺、亞楓、酸和多官能團(tuán)化合物第82頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六六、

液相色譜的流動(dòng)相1.流動(dòng)相實(shí)用要求（1）溶劑的純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過(guò)程的穩(wěn)定性和重復(fù)性要求。（2）避免使用與固定相發(fā)生不可逆反應(yīng)溶劑。

（使用AI2O3-避免酸、使用硅膠－避免堿）（3）溶劑應(yīng)不干擾使用檢測(cè)器的正常工作，與檢測(cè)器相匹配。⑷使用的溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去，不干擾對(duì)分離組分的回收。第83頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六2.流動(dòng)相分類(lèi)

按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：一般淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：

正相:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、正戊烷正庚烷反相:甲醇、乙腈、水溶液。

第84頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六３．LSC流動(dòng)相的選擇

在吸附色譜中,對(duì)溶質(zhì)保留值和分離選擇性起主導(dǎo)作用的是溶質(zhì)與固定相的作用,流動(dòng)相主要是調(diào)節(jié)溶質(zhì)的保留值在適當(dāng)范圍內(nèi)?！軇?qiáng)度↑→洗脫能力↑→k’↓液固吸附色譜的流動(dòng)相值要適當(dāng)，常用正己烷、正庚烷,添加少量CH2Cl2、CHCl3、CH3CN和CH3OH。

(混合后的溶劑強(qiáng)度在兩種純?nèi)軇┲g）

第85頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六液固色譜的應(yīng)用特點(diǎn)：●對(duì)具有不同極性取代基的化合物表現(xiàn)出較高的選擇性，但對(duì)同系物的分離能力較差●對(duì)強(qiáng)極性或離子型樣品，因有時(shí)會(huì)發(fā)生不可逆吸附，液固色譜常不能獲得滿意的分離結(jié)果。●吸附劑的含水量對(duì)吸附劑活性、樣品容量和保留值有較大影響

液固吸附色譜主要應(yīng)用于:

結(jié)構(gòu)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體的分離。

第86頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六思考：在液固色譜中，以硅膠為固定相，對(duì)以下四組分進(jìn)行分離，流出色譜柱的順序可能是：

１．a(chǎn).鄰苯二胺b．對(duì)苯二胺c．間苯二胺

２．a(chǎn).苯酚b.對(duì)羥基苯胺c.苯胺d.苯12第87頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§3-2反相鍵合相色譜

鍵合相色譜是目前HPLC中最常見(jiàn)的分離模式,約80%的HPLC是采用反相鍵合相色譜?！裢榛酵滴锓蛛x分析●多環(huán)芳烴分離分析第88頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六反相鍵合相色譜定義－固定相通過(guò)某種化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子以共價(jià)鍵結(jié)合在色譜擔(dān)體的表面，這種色譜類(lèi)型稱(chēng)之。制備硅膠基質(zhì)化學(xué)鍵合固定相注意點(diǎn)：①鍵合反應(yīng)前，將硅膠表面硅氧烷全部水解為硅烷醇。②除去硅膠表面吸附水，使表面完全呈自由硅醇基。第89頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

形成化學(xué)鍵合固定相

具備條件：①所用基質(zhì)材料應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性②有能與基質(zhì)表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)第90頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六化學(xué)鍵合固定相(P303)

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水，耐光，耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣

c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N第91頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)：（1）傳質(zhì)快:表面無(wú)深凹陷。（2）壽命長(zhǎng):化學(xué)鍵合，耐流動(dòng)相沖擊；穩(wěn)定。（3）選擇性好:可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性（4）有利于梯度洗脫。由于產(chǎn)生弱極性固定相，因而擴(kuò)展了反相色譜分離技術(shù)的應(yīng)用。反相色譜﹥正相色譜第92頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六存在著雙重分離機(jī)制：由鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主。

常用反相鍵合固定相：

C18、C8

P300～P302第93頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六反相色譜保留機(jī)理兩種觀點(diǎn):①疏溶劑理論（溶質(zhì)與極性溶劑疏遠(yuǎn)）②雙保留機(jī)理（殘留羥基）第94頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六影響溶質(zhì)保留的因素①流動(dòng)相組分的保留隨流動(dòng)相極性的減少而減少,

lnk’H2O%,有機(jī)溶劑%增大,極性下降,k’值隨之下降。思考：在ODS柱上，用70%甲醇/水或60%甲醇/水洗脫苯系物，哪一種流動(dòng)相使苯系物的保留值大，為什么？第95頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六②鍵合固定相：

a.烷基覆蓋量增加，k’值隨之增大。b.烷基鏈長(zhǎng)增加,k’值隨之增大。思考：

同樣是70%甲醇流動(dòng)相，苯在C18比C8柱上的保留值大，為什么？第96頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六③溶質(zhì)●非離子化合物：極性大,k’值小●非極性化合物：分子表面積大,k’值大●同系物：鏈長(zhǎng)增大,k’值增大●苯系物：環(huán)數(shù)增大,k’值增大;●若化合物的非極性部分相同,極性官能團(tuán)增加,則k’值下降●幾何異構(gòu)體：能形成內(nèi)氫鍵的異構(gòu)體的化合物k’值大。第97頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六碳鏈增大疏水性增大保留越大流動(dòng)相極性增大，保留增大第98頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六反相色譜中流動(dòng)相選擇水＋有機(jī)改善劑常用：甲醇、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán)極性：有機(jī)改善劑＜水洗脫能力：有機(jī)改善劑＞水極性順序：甲醇＞乙腈＞二氧六環(huán)＞四氫呋喃洗脫能力：水＜甲醇＜乙腈＜二氧六環(huán)＜四氫呋喃第99頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六反相鍵合相色譜的優(yōu)點(diǎn)：①流動(dòng)相可選用水溶性

ⅰ樣品的溶解度范圍提高

ⅱ流動(dòng)相可變性大

ⅲ柱重現(xiàn)性好②固定相表面化學(xué)能低ⅰ平衡容易ⅱ梯度洗脫③固定相選擇多④固定相耐溶劑沖洗⑤熱穩(wěn)定性好第100頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六缺點(diǎn)：①流動(dòng)相PH范圍要控制（PH＝2－8）pH太低：Si-C鍵易斷裂pH太高：硅膠基質(zhì)易溶解②游離的硅羥殘基影響分離（封尾）P328-331

第101頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六思考烷基苯同系物分離分析多環(huán)芳烴分離分析出峰順序？如何選擇色譜條件？如何優(yōu)化分離？第102頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第四章、離子交換色譜，離子對(duì)色譜離子交換色譜：適用于離子型物質(zhì)的分離和分析§4-1離子交換色譜一.原理：用離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動(dòng)相，樣品中各離子依據(jù)它們與離子交換劑的交換能力大小來(lái)進(jìn)行分離的色譜方法。第103頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六原理：

流動(dòng)相(溶質(zhì)離子)+離子交換劑(反離子)

Ｒ－Ａ＋Ｂ≒Ｒ－Ｂ＋Ａ

平衡時(shí)，平衡常數(shù)為第104頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

控制k’可以改變流動(dòng)相的離子強(qiáng)度

注：只有當(dāng)溶質(zhì)呈離子狀態(tài)時(shí)，才能在離子

交換柱上有保留

(流動(dòng)相pＨ和溶質(zhì)ＰＫａ都是很重要的參數(shù))第105頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六二、離子交換劑

陽(yáng)離子交換劑——帶負(fù)電荷官能團(tuán)

-SO3-(磺酸型）、-COO-(羧酸型）

陰離子交換劑——帶正電荷官能團(tuán)

－NH3＋（氨基型）、－NR3＋（季胺型）常見(jiàn)：硅膠為基體的鍵合相離子交換劑例第106頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六pH對(duì)交換容量的影響：①?gòu)?qiáng)酸、強(qiáng)堿性離子交換劑，交換性能不受pH影響，交換容量恒定。②弱酸性陽(yáng)離子交換劑，在較高pH條件下弱堿性陰離子交換劑，在較低pH條件下發(fā)生離子交換pH與交換容量關(guān)系圖第107頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六三、離子交換色譜的影響因素①流動(dòng)相PH的影響例：弱酸：HA≒H++A-PH↓→[A-]↓→交換能力↓→tR↓PH↑→[A-]↑→交換能力↑→tR↑

弱堿：-NH2+H+≒-NH3+PH↓→[NH3+]↑→交換能力↑→tR↑PH↑→[NH3+]↓→交換能力↓→tR↓對(duì)分離不同PKa的酸堿是個(gè)有利因素例第108頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六②流動(dòng)相中反離子的形式和濃度

交換平衡常數(shù)KB/A：反映了溶質(zhì)和交換劑的親和力大小

親合力影響因素：a.電荷數(shù)↑→親合力↑b.離子的水合體積↓→親合力↑c(diǎn).離子極化率↑→親合力↑

第109頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六對(duì)磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，一價(jià)陽(yáng)離子的洗脫強(qiáng)度順序：

Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+二價(jià)陽(yáng)離子的洗脫強(qiáng)度順序：

Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Cd2+>Cu2+對(duì)季胺型陰離子交換樹(shù)脂，陰離子的洗脫強(qiáng)度順序：ClO4->I->HSO4->SCN->NO3->Br->NO2->CN->Cl->BrO3->OH->HCO3->H2PO4->IO3->CH3COO->F-注：調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度常用Na2SO4、NaNO3,不采用NaCI增加離子強(qiáng)度類(lèi)似于增加洗脫強(qiáng)度第110頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六三者相互作用力關(guān)系：ⅰ.溶質(zhì)對(duì)R+的親合力↑→交換能力↑

→tR↑ⅱ.流動(dòng)相離子對(duì)R+親合力↑→洗脫能力

↑→tR↓③有機(jī)溶劑影響有機(jī)溶劑↑→溶劑強(qiáng)度↑→洗脫能力↑→k’↓P335～337第111頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六四.離子抑制法定義——在反相色譜中，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，抑制組分解離，增加其在固定相上的保留，以達(dá)到分離的目的。分離對(duì)象：弱酸、弱堿性物質(zhì)k′影響因素：與流動(dòng)相pH值有關(guān)弱酸HA:pH↓→[HA]↑→疏水締合↑→tR↑→k’↑pH↑→[HA]↓→疏水締合↓→tR↓→k’↓弱堿A:pH↑→[HA+]↓→tR↑→k’↑pH↓→[HA+]↑→tR↓→k’↓pH-k’關(guān)系曲線圖

但對(duì)強(qiáng)酸，強(qiáng)堿不適合。為什么？第112頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§4-2離子對(duì)色譜

P333～335

定義-將一種與溶質(zhì)離子電荷相反的離子(反離子)，加到流動(dòng)相中與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)，能夠在兩相之間進(jìn)行分配。反相離子對(duì)色譜：

非極性的疏水固定相(C18柱)，含有反離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X(jué)-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)X-Y+。

X+水相+Y-水相=X+Y-有機(jī)相

第113頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六基本原理：

X+水相+Y-水相=X+Y-有機(jī)相形成的離子對(duì)化合物X+Y-，在兩相間進(jìn)行分配

平衡常數(shù)：溶質(zhì)的容量因子k’為：第114頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六容量因子隨KXY和[Y-]水相的增大而延長(zhǎng)，而KXY取決于反離子和固定相的性質(zhì)，則控制流動(dòng)相中加入的反離子特性和濃度可以調(diào)節(jié)組分保留時(shí)間，達(dá)到提高色譜分離選擇性的目的。第115頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六常見(jiàn)：固定相：化學(xué)鍵合相流動(dòng)相：緩沖溶液（含反離子)＋有機(jī)改善劑離子對(duì)試劑:陰離子分離：常用烷基銨類(lèi)（十六烷基三甲胺、四丁基胺）

陽(yáng)離子分離：常用烷基磺酸鹽(己烷磺酸鈉、高氯酸鹽)。第116頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六四、影響反相離子對(duì)色譜分離選擇性因素1.溶劑極性的影響極性↓→有機(jī)溶劑比例↑→洗脫強(qiáng)度↑→k’↓2.離子強(qiáng)度的影響水溶液中離子強(qiáng)度↑→洗脫能力↑→k’↓3.PH值的影響弱酸：PH值接近7→組分完全電離→最易形成離子對(duì)→k’最大PH↓→X-→HX→固定相中離子對(duì)減少→k’↓一般：PH=2～7.4PH＞8硅膠溶解

第117頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六4.離子對(duì)試劑性質(zhì)和濃度的影響離子對(duì)試劑烷基鏈↑→疏水性↑→締合物k’↑無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)試劑→疏水性減少→締合物k’↓離子對(duì)試劑濃度：10-4~10-2mol/L5.溫度的影響流動(dòng)相粘度大,溫度↑→柱效↑第118頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六思考:1.反相離子對(duì)色譜中，那些因素影響組分的保留？如何影響？2.離子交換色譜中，溶質(zhì)、固定相、流動(dòng)相三者間具有怎樣的關(guān)系？它們是如何影響組分的保留的？第119頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第五章:體積排阻色譜法

(凝膠色譜法)根據(jù)化合物分子大小和形狀差別進(jìn)行分離的方法分離對(duì)象:高分子化合物、生物大分子樣品、蛋白質(zhì)樣品。固定相：凝膠(具有一定大小孔徑分布)

第120頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；凝膠色譜的校正曲線

㏒M~V關(guān)系曲線(分子量越小，滲透越深，洗脫體積越大）第121頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六凝膠色譜特點(diǎn)：a.樣品峰全部在溶劑的保留時(shí)間前洗脫b.柱內(nèi)的峰擴(kuò)展較小c.峰較窄，有利于檢測(cè)d.采用示差檢測(cè)器不足：a.峰容量小b.不能分離大小相似、分子量接近的組分第122頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六固定相（1）半剛性凝膠高交聯(lián)度的聚苯乙烯，孔徑范圍較寬。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相?？讖僵?0nm分子量103孔徑10～200nm分子量50～107（2）剛性凝膠多孔硅膠，它既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作，但易拖尾。第123頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六凝膠的選擇:滲透極限－可以分離的最高分子量（與孔徑有關(guān):孔徑大，滲透極限大）分離范圍－校正曲線的線性部分不同凝膠有不同的滲透極限和分離范圍第124頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

移動(dòng)相選擇P321～326,339～341a.能溶解樣品b.不應(yīng)造成填料太大的溶脹或收縮c.控制PH和離子強(qiáng)度，可消除非排除機(jī)理的影響（離子強(qiáng)度0.05~0.1常用磷酸鹽或硫酸鹽PH接近中性為宜）d.盡量降低溶劑粘度（加電介質(zhì)）e.選擇與樣品折射率差別大的溶劑，提高靈敏度樣品濃度：0.01~0.5%常用：甲苯、苯、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、四氫呋喃、水溶液第125頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

色譜分離方法的選擇

要正確地選擇色譜分離方法，必須做到①了解樣品的有關(guān)性質(zhì).②熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。

選擇色譜分離方法的主要依據(jù)：①樣品的分子量的大小，②在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度③化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。第126頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六一、分子量對(duì)于分子量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。分子量在200～2000的化合物，可用液固吸附、鍵合相色譜和離子交換色譜法。分子量高于2000，則可用排阻色譜法。第127頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六二、溶解度

水溶性樣品最好用離子交換色譜法和離子對(duì)色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對(duì)非極性的混合物，可用液-固色譜法。第128頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六三、化學(xué)結(jié)構(gòu)

若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，可首先考慮用離子交換色譜。異構(gòu)體的分離可用液固色譜法；同系物可用反相鍵合相色譜法；對(duì)于高分子聚合物，可用體積排阻色譜法第129頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六小結(jié):a.已知結(jié)構(gòu)試樣→查閱文獻(xiàn)資料→以其他色譜分離技術(shù)作參考b.分子量較大（M＞2000）蛋白質(zhì)、高聚物→凝膠色譜法c.分子量較?。∕＜2000）試樣→多種溶劑中溶解度情況決定分離類(lèi)型、填料、流動(dòng)相由于試樣組分的復(fù)雜性，還需對(duì)試樣的來(lái)源、性質(zhì)等作詳細(xì)了解，以作選擇參考。第130頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六分離類(lèi)型選擇第131頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

應(yīng)用

目前已普及于幾乎所有重要的分析學(xué)科領(lǐng)域和許多科研生產(chǎn)部門(mén)，高效液相色譜能較理想地分離和分析與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)的大分子和離子型物質(zhì)，各種高分子化合物和不穩(wěn)定化合物。

例如：蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖、顏料極性類(lèi)脂肪化合物、藥物、染料、表面活性劑、農(nóng)藥、甾族化合物、多環(huán)芳烴、合成聚合物、瞟吟、維生素、除銹劑、防老劑等等。

第132頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

第133頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第134頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第135頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第136頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六農(nóng)藥的分析第137頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第138頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六第六章、實(shí)驗(yàn)技術(shù)和輔助實(shí)驗(yàn)技術(shù)§6－1定性和定量分析一、定性分析①利用保留值定性a.與標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)照b.將標(biāo)準(zhǔn)物加入樣品中c.二極管陣列檢測(cè)器②液相-質(zhì)譜聯(lián)用③收集洗脫液后定性分析第139頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六二、定量分析①標(biāo)準(zhǔn)曲線法（外標(biāo)法）

是一種簡(jiǎn)便、快速的絕對(duì)定量方法。步驟：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確進(jìn)樣，用峰面積或峰高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。將被測(cè)組分在相同的色譜條件下進(jìn)樣，由峰面積或峰高根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其濃度特點(diǎn)：①適用于大量分析②色譜條件完全相同第140頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六②歸一化法（所有組分都出峰,并在檢測(cè)器上都有信號(hào)）③內(nèi)標(biāo)法（選取合適內(nèi)標(biāo)物。準(zhǔn)確度，精密度較好）④標(biāo)準(zhǔn)加入法（加入標(biāo)準(zhǔn)樣品，利用加入前后峰面積變化計(jì)算）第141頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六三、影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度因素①樣品制備a.樣品溶劑與洗脫液互溶性好b.將干擾組分盡可能分離c.含量低時(shí)必須富集回收率試驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)物加入到已知含量被測(cè)樣品中→用制備樣品同樣方法處理→定量測(cè)定，得回收率?；厥章剩剑y(cè)定值－樣品值）/加入量目的：檢驗(yàn)被測(cè)組分在制備中是否100%定量轉(zhuǎn)化第142頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六

儲(chǔ)存條件：低溫、干燥、避光樣品制備方法：a.溶解（超聲波、離心）b.濃縮c.萃取d.預(yù)分離e.衍生化②進(jìn)樣技術(shù)影響因素：a.進(jìn)樣裝置的準(zhǔn)確度和精度b.分析人員對(duì)進(jìn)樣技術(shù)的熟練程度進(jìn)樣－六通進(jìn)樣閥定量：進(jìn)樣管3－4倍第143頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六③檢測(cè)器特性穩(wěn)定性和線性范圍直接影響定量準(zhǔn)確性a.被測(cè)組分濃度和響應(yīng)值呈線性關(guān)系b.進(jìn)樣量不能超出線性范圍注：定量分析不宜采用梯度洗脫（基線易漂移）第144頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六§6－2HPLC實(shí)驗(yàn)技術(shù)一、色譜柱的保養(yǎng)①新柱要作凈化處理②平時(shí)使用：a.正式進(jìn)樣前，先用流動(dòng)相沖平衡b.一種流動(dòng)相換另一種時(shí)，需互溶③柱的儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于相對(duì)惰性溶劑中（反相柱用甲醇）④對(duì)復(fù)雜樣品或易污染樣品，應(yīng)裝預(yù)柱⑤實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，當(dāng)洗脫液用緩沖液，應(yīng)先水沖柱→甲醇保護(hù)第145頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六二、流動(dòng)相的處理①流動(dòng)相的脫氣原因：a.高柱壓下流動(dòng)相中空氣，會(huì)在柱的洗脫液流中形成氣泡，干擾檢測(cè)器信號(hào)。b.除去氧（氧易與固定相、流動(dòng)相反應(yīng)，不利于柱穩(wěn)定）脫氣方法：a.真空脫氣法b.惰性氣體吹脫法c.超聲波脫氣法第146頁(yè)，共167頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)7分，星期六②流動(dòng)相的純化a.將溶劑通過(guò)干燥的多孔硅膠漏斗（0.45μ)b.在進(jìn)樣器之