雞綠膿桿菌的分離鑒定與毒力試驗

第6頁共6頁雞綠膿桿菌的分離鑒定與毒力試驗【摘要】：^p：20________年～20________年臨床上從雞場分離到15株綠膿桿菌，進行細菌的鑒定，調查雞群中綠膿桿菌的血清型，了解雞群發(fā)病情況，雞群中綠膿桿菌主要存在三種血清型，其中G型最多，有11株，占總數(shù)的73.3%，B型次之，有3株，占總數(shù)的20%，C型最少，1株，占總數(shù)的6.7%。分離菌株進行小白鼠的毒力試驗，觀察綠膿桿菌的毒力，不同菌株對小白鼠的毒力不一樣，其中G型最小致死劑量2____107CFU/0.3ml，B型最小致死劑量5____107CFU/0.3ml，C型最小致死劑量10____107CFU/0.3ml?！娟P鍵詞】：^p：雞；綠膿桿菌；鑒定；毒力中圖分類號：S858.31文獻標識碼：B文章編號：2096-3637（20________）04-0006-03綠膿桿菌病是由綠膿桿菌引起的一種人畜共患病。綠膿桿菌又叫綠膿假單胞菌，屬于假單胞菌科假單胞菌屬。綠膿桿菌是一種條件致病菌，常見的眼觀癥狀是在感染后可見到綠色的濃汁，所以稱為綠膿桿菌。機體抵抗力低的時候容易發(fā)病，特別是集約化養(yǎng)殖的雞場以及鴨場綠膿桿菌的發(fā)病率較高，常常引起急性敗血癥死亡[1]。綠膿桿菌革蘭氏陰性小桿菌，不產生芽孢，只有一根鞭毛，顯微鏡運動活潑。廣泛分布于土壤、水和空氣中，潮濕的污水中常年存在，該菌營養(yǎng)要求比較低，一般的環(huán)境都可以生長，可感染眾多哺乳動物、禽類、爬行類和魚類[2]，一般情況下健康的人和動物不患病，但是在機體抵抗力低下時容易引發(fā)綠膿桿菌病，有時是天氣變化、轉群、疫苗免疫等等應激因素促進該病的發(fā)生。雛雞容易感染綠膿桿菌[3]，造成嚴重的經(jīng)濟損失，感染后的癥狀主要是發(fā)病急促、病程短、精神沉郁、衰竭、脫水、皮下水腫[4]。綠膿桿菌容易檢測和治療，但是使用抗菌藥物治療后，原來的敏感抗菌藥物容易變成耐藥[5]，疫苗的使用將是以后的研究方向。1材料和方法1.1試驗菌株20________年～20________年從發(fā)病養(yǎng)殖場分離到的綠膿桿菌15株1.2試驗動物18～22g小白鼠，購自山東大學實驗動物中心；7日齡雞，購自濟南章丘某養(yǎng)殖場。1.3器材生物安全柜，蘇凈安泰，型號BSC-1600IIA2；基因擴增儀，杭州博日科技有限公司，型號TC-96/G/H（b）c；顯微鏡，奧林巴斯，型號C____-31；恒溫培養(yǎng)箱，三洋，型號MCO-15AC；全自動樣品快速研磨儀，上海凈信科技，型號Tiss-24。微量藥敏片，購自杭州天和生物試劑有限公司；綠膿菌素鑒定培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、馬丁肉湯粉，購自青島海博試劑公司；細菌微量生化反應小管，購自北京路橋試劑公司；B型、C型、G型綠膿菌素陽性定型鑒定血清，購自日本力生株式會社；牛血清，購自濟南勁牛試劑公司；高壓鍋、超聲波清洗機、解剖臺、解剖刀、剪刀、酒精燈、接種環(huán)、試管，實驗室常備物品。1.3.1細菌分離與鑒定發(fā)現(xiàn)精神沉郁、衰竭、脫水，眼睛腫、皮下水腫病雞進行檢測，著重檢測綠膿桿菌，無菌條件下取肝臟，接種10%血清的營養(yǎng)瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)16h，觀察細菌細菌生長情況。疑似綠膿桿菌的菌落再進行細菌革蘭氏染色，觀察細菌形態(tài)，轉接綠膿菌素鑒定培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、綿羊鮮血培養(yǎng)基，記錄細菌狀況和生長特性。1.4生化試驗將分離的疑似綠膿桿菌的細菌全部進行生化試驗。1.4.1氧化酶試驗加2滴1%四甲基對苯二胺試劑于濾紙上，用牙簽挑去1個菌落到紙上涂布，若5s內由粉色變?yōu)楹谏?，則判為陽性。1.4.2觸酶試驗取干凈的載玻片，在上面滴加1%過氧化氫溶液，挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)的分離菌，在過氧化氫溶液中混合，若有氣泡則觸酶試驗陽性。1.4.3硝酸鹽還原試驗先制備溶液，甲液：甲基萘胺0.6g，5mol/L冰醋酸100ml，稍加熱，脫脂棉過濾，放棕色瓶。乙液：對氨基苯磺酸0.8g，用5mol/L冰醋酸30ml溶解對氨基苯磺酸，定溶至100ml，放帶玻璃瓶塞的玻璃瓶中。把菌接種在硝酸鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，加甲液和乙液各3滴，30s出現(xiàn)紅色則為陽性，若無顏色加少量的鋅，隨后出現(xiàn)紅色則為陰性。1.4.4脂酶試驗將菌接種在含維多利亞藍的脂酶中，35℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基顏色變?yōu)樗{色，則脂酶試驗陽性，無顏色或者粉色則為陰性。1.4.5甲基紅試驗將菌接種在葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育48h，于5ml培養(yǎng)基中滴加5滴甲基紅指示劑，立即觀察結果，培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色為陽性，黃色為陰性。1.4.6VP試驗將菌接種葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育24h，加入50gL-萘酚0.6ml，輕輕振搖試管，然后加入0.2ml400g/LKOH，輕輕振搖30min，然后靜止觀察結果，15min后呈現(xiàn)紅色的為陽性，不變顏色的為陰性。1.4.7硫化氫試驗將待檢菌接種含硫化物及亞鐵離子的培養(yǎng)基中，35℃孵育18h，若有黑色沉淀出現(xiàn)，判為陽性。1.4.8明膠液化試驗將菌接種明膠培養(yǎng)基，35℃孵育24h至7日，每24h取樣放入4℃冰箱2h，觀察有無凝固，若呈現(xiàn)液態(tài)不凝固，判為陽性。1.4.9吲哚試驗將菌液接種富含色氨酸的蛋白