《DNA重組技術(shù)的基本工具》課件1

專題1基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具專題1基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具1基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。一、基因工程的概念：

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)2一、基因工程的概念：

別名原理操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程最終目的基因重組生物體外基因/DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)定向改造生物的遺傳性狀基因拼接技術(shù)、DNA重組技術(shù)一、基因工程的概念：別名原理3基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾4基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德5基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論

摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論6基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論7基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論8基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞9基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里10基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論111、基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2、工具酶的發(fā)明3、DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4、DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5、重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功6、第一例轉(zhuǎn)基因生物的問世7、PCR技術(shù)的發(fā)明（二）技術(shù)發(fā)明：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程1、基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)（二）技術(shù)發(fā)明：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生12基因工程的產(chǎn)物基因工程的產(chǎn)物13問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。蘇云14基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金桿菌提取抗蟲基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？1.1DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金桿15基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞一、DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽16解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體1.1、DNA重組技術(shù)的基本工具解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限17①來源：主要從原核生物中分離純化出來。②種類：已從近300種微生物中分離出約4000種限制酶。③作用：1.能識(shí)別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列2.使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。一、限制性核酸內(nèi)切酶—“分子手術(shù)刀”①來源：主要從原核生物中分離純化出來。②種類：已從近300種18T磷酸二酯鍵1234512345AT磷酸二酯鍵1234512345A19DNA分子磷酸二酯鍵切割DNA分子實(shí)質(zhì)是斷開兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。一、限制性核酸內(nèi)切酶—“分子手術(shù)刀”DNA分子磷酸二酯鍵切割DNA分子實(shí)質(zhì)是斷開兩個(gè)核20思考：在自然界中有一些生物的DNA可能進(jìn)入另一種生物的細(xì)胞中。我們有沒有學(xué)過相關(guān)的實(shí)例？現(xiàn)今存在的生物為什么沒有在長期的進(jìn)化過程中被外源DNA的入侵而滅絕，仍能保持一種穩(wěn)定狀態(tài)？怎樣才能使外來的DNA失效從而保護(hù)自身？思考：在自然界中有一些生物的DNA可能進(jìn)入另一種生物的細(xì)胞中21《DNA重組技術(shù)的基本工具》課件122尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？防止外來病原物的侵害。當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？防止23思考與探究為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。思考與探究為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？24具有特異性。一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子.④作用特點(diǎn)：大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成⑤限制酶的識(shí)別序列：⑥結(jié)果:形成兩種末端粘性末端平末端一、限制性核酸內(nèi)切酶—“分子手術(shù)刀”具有特異性。④作用特點(diǎn)：大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列25限制酶的識(shí)別序列：中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ、重復(fù)排列的限制酶的識(shí)別序列：中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ、26GCTTAAGCTTAAEcoRⅠ識(shí)別特定核苷酸序列SmaⅠGCGCGCGCGGCC中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對稱、重復(fù)排列的。序列特點(diǎn)：GCTTAAGCTTAAEcoRⅠ識(shí)別特定核苷酸序列SmaⅠ27大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制性核酸內(nèi)切酶基因的剪刀——限制性核酸內(nèi)切酶大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識(shí)別G28基因的剪刀——限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶基因的剪刀——限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶29

EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端30

EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端31什么叫黏性末端？當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)切開時(shí)，被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。什么叫黏性末端？當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)切開32什么叫平末端？當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。什么叫平末端？當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)33SmaⅠ平末端平末端SmaⅠ平末端平末端34CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAGCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG

目的基因黏性末端CTTCATG35要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？（被同一種限制酶切斷的幾個(gè)來源不同的DNA是否具有相同的黏性末端？）會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾36DNA連接酶──“分子縫合針”切斷的DNA片段要與受體細(xì)胞的DNA連接，你覺得可以用什么酶？DNA聚合酶和DNA連接酶有何相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？DNA連接酶──“分子縫合針”切斷的DNA片段要與受體細(xì)胞37把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來.作用：二、“分子縫合針”——DNA連接酶作用過程：催化磷酸二酯鍵形成作用原理：把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫38CTTAAGAATTCG連接酶BACKCTTAAGAATTCG連接酶BACK39類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別（二）“分子縫合針”——DNA連接酶類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大40可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·co41

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效42DNA聚合酶DNA聚合酶43……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合將不同種來源的DNA片段連接起來生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……酶切……GAATTC…………GAATTC……EcoRⅠ……GAA44DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來，不需要模板二、DNA連接酶——“分子縫合針”DNA聚合酶DNA連接酶相同點(diǎn)DNA連接酶與DNA聚合酶是45外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)？三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體-“分子運(yùn)輸車”導(dǎo)入過程需要運(yùn)輸工具——載體。載體的作用有哪些？作用一：作為運(yùn)載工具，將外源基因(抗蟲基因)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)中去。作用二：利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)內(nèi)，對外源基因(抗蟲基因)進(jìn)行大量復(fù)制。外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)？46作為載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等）。4）必須是安全的。5)大小應(yīng)適合。三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體-“分子運(yùn)輸車”作為載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地473.載體的種類：⑴質(zhì)粒（最常用）⑵λ噬菌體的衍生物⑶某些動(dòng)植物病毒3.載體的種類：⑴質(zhì)粒（最常用）48常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)49抗Amp含有Amp的培養(yǎng)基抗Amp含有Amp的培養(yǎng)基50假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？作為載體沒有切割位點(diǎn)將怎樣？目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺？如果載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？不能分離會(huì)怎樣？思考：假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？思考：51假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？思考：導(dǎo)入受體細(xì)胞的目的基因不能復(fù)制，將在細(xì)胞增殖中丟失。作為載體沒有切割位點(diǎn)將怎樣？載體沒有切割位點(diǎn)，外源的目的基因不可能插入。假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？思考：導(dǎo)入受體細(xì)胞52目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺？如果載體上有遺傳標(biāo)記基因，這樣，在載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，就可通過標(biāo)記基因的表達(dá)來檢測。如果載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？不能分離會(huì)怎樣？載體對受體細(xì)胞有害，將影響受體細(xì)胞新陳代謝，進(jìn)而使轉(zhuǎn)入的目的基因也無立足之地。載體不能分離，就不能獲得更多帶有目的基因的載體。目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺？如果載體上有遺傳標(biāo)記基53模擬操作：重組DNA分子的模擬操作注意：這兩條DNA分子的堿基對不是隨意亂寫的。首先，每個(gè)DNA分子上的兩條鏈上的堿基要互補(bǔ)配對；第二，每個(gè)DNA分子中每條鏈都存在一個(gè)G-A-A-T-T-C的堿基序列，也就是說是EcoRI限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，并存在G-A的切割位點(diǎn)。模擬操作：重組DNA分子的模擬操作注意：這兩條DNA分子的堿54274836152748361555小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識(shí)別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運(yùn)載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡單,大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因質(zhì)粒、噬菌體

、動(dòng)植物病毒小結(jié)基因工程限制酶主要存在于原核生物中DNA連連接磷酸二酯562、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？思考與探究P72、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？思考573、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。思考與探究P73、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？迄今為止，所發(fā)58隨堂練習(xí)1、關(guān)于限制酶的說法中，正確的是（）A、限制酶是一種酶，只識(shí)別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是G—A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C隨堂練習(xí)1、關(guān)于限制酶的說法中，正確的是（）答案：C592.（多選）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是A、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種B、重組DNA的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體答案：BD2.（多選）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是答案：BD603、不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是（）A、能復(fù)制B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀DNA答案：D3、不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是（614、在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（）A.同種限制酶B.兩種限制酶C.同種連接酶D.兩種連接酶A4、在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使625、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的步驟是（）A、人工合成目的基因B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D、目的基因的檢測和表達(dá)C5、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的636.同一種限制酶切割成的黏性末端是（）A.①②B.①③C.①④D.②③A6.同一種限制酶切割成的黏性末端是（）A.①②647.下列說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的載體C、載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D、DNA連接酶使黏性末段的堿基之間形成氫鍵C7.下列說法正確的是（）C658.有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）A、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種B、重組DNA的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、目的基因須由載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、質(zhì)?？勺鳛檩d體

B8.有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）B669.有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D9.有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）D6710.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的步驟是（）A、人工合成目的基因B、目的基因與載體結(jié)合C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D、目的基因的檢測和表達(dá)C10.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作6811.下列關(guān)于質(zhì)粒的敘述，正確的是()A、質(zhì)粒是廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中的一種顆粒狀細(xì)胞器B、質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中能夠自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子C、質(zhì)粒只有在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后才能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制D、細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制過程一定是在宿主細(xì)胞外獨(dú)立進(jìn)行的B11.下列關(guān)于質(zhì)粒的敘述，正確的是()69《DNA重組技術(shù)的基本工具》課件170利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因71《DNA重組技術(shù)的基本工具》課件172專題1基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具專題1基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具73基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。一、基因工程的概念：

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)74一、基因工程的概念：

別名原理操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程最終目的基因重組生物體外基因/DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)定向改造生物的遺傳性狀基因拼接技術(shù)、DNA重組技術(shù)一、基因工程的概念：別名原理75基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾76基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德77基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論

摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論78基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論79基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論80基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞81基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里82基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論831、基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2、工具酶的發(fā)明3、DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4、DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5、重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功6、第一例轉(zhuǎn)基因生物的問世7、PCR技術(shù)的發(fā)明（二）技術(shù)發(fā)明：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程1、基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)（二）技術(shù)發(fā)明：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生84基因工程的產(chǎn)物基因工程的產(chǎn)物85問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。蘇云86基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金桿菌提取抗蟲基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？1.1DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金桿87基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞一、DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽88解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體1.1、DNA重組技術(shù)的基本工具解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限89①來源：主要從原核生物中分離純化出來。②種類：已從近300種微生物中分離出約4000種限制酶。③作用：1.能識(shí)別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列2.使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。一、限制性核酸內(nèi)切酶—“分子手術(shù)刀”①來源：主要從原核生物中分離純化出來。②種類：已從近300種90T磷酸二酯鍵1234512345AT磷酸二酯鍵1234512345A91DNA分子磷酸二酯鍵切割DNA分子實(shí)質(zhì)是斷開兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。一、限制性核酸內(nèi)切酶—“分子手術(shù)刀”DNA分子磷酸二酯鍵切割DNA分子實(shí)質(zhì)是斷開兩個(gè)核92思考：在自然界中有一些生物的DNA可能進(jìn)入另一種生物的細(xì)胞中。我們有沒有學(xué)過相關(guān)的實(shí)例？現(xiàn)今存在的生物為什么沒有在長期的進(jìn)化過程中被外源DNA的入侵而滅絕，仍能保持一種穩(wěn)定狀態(tài)？怎樣才能使外來的DNA失效從而保護(hù)自身？思考：在自然界中有一些生物的DNA可能進(jìn)入另一種生物的細(xì)胞中93《DNA重組技術(shù)的基本工具》課件194尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？防止外來病原物的侵害。當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？防止95思考與探究為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。思考與探究為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？96具有特異性。一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子.④作用特點(diǎn)：大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成⑤限制酶的識(shí)別序列：⑥結(jié)果:形成兩種末端粘性末端平末端一、限制性核酸內(nèi)切酶—“分子手術(shù)刀”具有特異性。④作用特點(diǎn)：大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列97限制酶的識(shí)別序列：中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ、重復(fù)排列的限制酶的識(shí)別序列：中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ、98GCTTAAGCTTAAEcoRⅠ識(shí)別特定核苷酸序列SmaⅠGCGCGCGCGGCC中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對稱、重復(fù)排列的。序列特點(diǎn)：GCTTAAGCTTAAEcoRⅠ識(shí)別特定核苷酸序列SmaⅠ99大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制性核酸內(nèi)切酶基因的剪刀——限制性核酸內(nèi)切酶大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識(shí)別G100基因的剪刀——限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶基因的剪刀——限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶101

EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端102

EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端103什么叫黏性末端？當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)切開時(shí)，被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。什么叫黏性末端？當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)切開104什么叫平末端？當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。什么叫平末端？當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)105SmaⅠ平末端平末端SmaⅠ平末端平末端106CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAGCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG

目的基因黏性末端CTTCATG107要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？（被同一種限制酶切斷的幾個(gè)來源不同的DNA是否具有相同的黏性末端？）會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾108DNA連接酶──“分子縫合針”切斷的DNA片段要與受體細(xì)胞的DNA連接，你覺得可以用什么酶？DNA聚合酶和DNA連接酶有何相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？DNA連接酶──“分子縫合針”切斷的DNA片段要與受體細(xì)胞109把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來.作用：二、“分子縫合針”——DNA連接酶作用過程：催化磷酸二酯鍵形成作用原理：把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫110CTTAAGAATTCG連接酶BACKCTTAAGAATTCG連接酶BACK111類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別（二）“分子縫合針”——DNA連接酶類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大112可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·co113

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效114DNA聚合酶DNA聚合酶115……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合將不同種來源的DNA片段連接起來生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……酶切……GAATTC…………GAATTC……EcoRⅠ……GAA116DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來，不需要模板二、DNA連接酶——“分子縫合針”DNA聚合酶DNA連接酶相同點(diǎn)DNA連接酶與DNA聚合酶是117外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)？三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體-“分子運(yùn)輸車”導(dǎo)入過程需要運(yùn)輸工具——載體。載體的作用有哪些？作用一：作為運(yùn)載工具，將外源基因(抗蟲基因)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)中去。作用二：利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)內(nèi)，對外源基因(抗蟲基因)進(jìn)行大量復(fù)制。外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)？118作為載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等）。4）必須是安全的。5)大小應(yīng)適合。三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體-“分子運(yùn)輸車”作為載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地1193.載體的種類：⑴質(zhì)粒（最常用）⑵λ噬菌體的衍生物⑶某些動(dòng)植物病毒3.載體的種類：⑴質(zhì)粒（最常用）120常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)121抗Amp含有Amp的培養(yǎng)基抗Amp含有Amp的培養(yǎng)基122假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？作為載體沒有切割位點(diǎn)將怎樣？目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺？如果載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？不能分離會(huì)怎樣？思考：假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？思考：123假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？思考：導(dǎo)入受體細(xì)胞的目的基因不能復(fù)制，將在細(xì)胞增殖中丟失。作為載體沒有切割位點(diǎn)將怎樣？載體沒有切割位點(diǎn)，外源的目的基因不可能插入。假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？思考：導(dǎo)入受體細(xì)胞124目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺？如果載體上有遺傳標(biāo)記基因，這樣，在載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，就可通過標(biāo)記基因的表達(dá)來檢測。如果載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？不能分離會(huì)怎樣？載體對受體細(xì)胞有害，將影響受體細(xì)胞新陳代謝，進(jìn)而使轉(zhuǎn)入的目的基因也無立足之地。載體不能分離，就不能獲得更多帶有目的基因的載體。目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺？如果載體上有遺傳標(biāo)記基125模擬操作：重組DNA分子的模擬操作注意：這兩條DNA分子的堿基對不是隨意亂寫的。首先，每個(gè)DNA分子上的兩條鏈上的堿基要互補(bǔ)配對；第二，每個(gè)DNA分子中每條鏈都存在一個(gè)G-A-A-T-T-C的堿基序列，也就是說是EcoRI限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，并存在G-A的切割位點(diǎn)。模擬操作：重組DNA分子的模擬操作注意：這兩條DNA分子的堿1262748361527483615127小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識(shí)別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運(yùn)載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡單,大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因質(zhì)粒、噬菌體

、動(dòng)植物病毒小結(jié)基因工程限制酶主要存在于原核生物中DNA連連接磷酸二酯1282、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？思考與探究P72、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？思考1293、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。思考與探究P73、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？迄今為止，所發(fā)130隨堂練習(xí)1、關(guān)于限制酶的說法中，正確的是（