dna重組技術(shù)的原理及步驟 課件

DNA重組技術(shù)的原理及步驟

第五組：鄭桂賢DNA重組技術(shù)的原理及步驟一、發(fā)展歷史1951年，美國(guó)學(xué)者E．萊德伯格等發(fā)現(xiàn)了噬菌體。1957年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了抗藥性質(zhì)粒。20世紀(jì)70年代初，生物化學(xué)研究的進(jìn)展也為重組DNA技術(shù)奠定了基礎(chǔ)1978年，諾貝爾生醫(yī)獎(jiǎng)?lì)C給發(fā)現(xiàn)DNA

限制酶的納森斯、亞伯與史密斯時(shí)，斯吉巴爾斯基在《基因》期刊中寫(xiě)道：限制酶將帶領(lǐng)我們進(jìn)入合成生物學(xué)的新時(shí)代?；蚬こ?、遺傳工程、分子克隆作為DNA重組技術(shù)的代名詞被廣泛使用。一、發(fā)展歷史1951年，美國(guó)學(xué)者E．萊德伯格等發(fā)現(xiàn)了噬菌體。二、DNA重組技術(shù)的原理1.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇與構(gòu)建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導(dǎo)入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達(dá)二、DNA重組技術(shù)的原理1.目的基因的獲取三、

DNA重組技術(shù)的步驟

1.分：分離目的基因

2.切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割

3.接：目的基因與載體連接

4.轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

5.篩：篩選出含有重組體的受菌體三、DNA重組技術(shù)的步驟RecombinantDNATechnology①?gòu)募?xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因⑦重組體的篩選RecombinantDNATechnology①?gòu)募?xì)胞（一）分：目的基因的獲取

1.化學(xué)合成法:較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物、測(cè)序引物、核酸雜交探針、定點(diǎn)突變

2.基因組DNA、cDNA3.聚合酶鏈反應(yīng)（一）分：目的基因的獲取

1.化學(xué)合成法:較短的基因（cDNA文庫(kù)基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA基因組DNA文庫(kù)限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝cDNA文庫(kù)基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA基因組DNA文庫(kù)克隆載體的選擇和構(gòu)建

理想載體具備的條件：可轉(zhuǎn)移性、復(fù)制功能、多克隆位點(diǎn)（廣泛、特異）、顯著的篩選標(biāo)志，便于篩選和鑒定、安全性常用克隆載體：質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA

質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子；具有自我復(fù)制功能；帶有抗性基因及表型識(shí)別等遺傳性標(biāo)記;經(jīng)改造后具有多克隆位點(diǎn)。pBR322是一個(gè)人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒，有萬(wàn)能質(zhì)粒之稱。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三個(gè)親本質(zhì)粒經(jīng)復(fù)雜的重組過(guò)程構(gòu)建而成的。克隆載體的選擇和構(gòu)建

理想載體具備的條件：可轉(zhuǎn)移性、復(fù)制功多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker質(zhì)粒載體多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker（二）切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割（二）切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割（1）與DNA分子相關(guān)的幾種酶及基因工程的其他工具

（1）與DNA分子相關(guān)的幾種酶及基因工程的其他工具

限制性內(nèi)切核酸酶

在特異位點(diǎn)上切割DNA分子分三類，常用為Ⅱ類酶識(shí)別序列呈回文對(duì)稱5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識(shí)別序列HaeⅠ的識(shí)別序列限制性內(nèi)切核酸酶

在特異位點(diǎn)上切割DNA分子5’-GAAT（三）接：目的基因與載體連接

(三)連接策略

1.粘端DNA間的連接

(1)同一限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)連接

(2)不同限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)連接

2.平端DNA間的連接

3.同聚物加尾連接

4.人工接頭連接（三）接：目的基因與載體連接

(三)連接策略粘端連接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA連接酶粘端連接CCGGCCGGGGC平端連接

AGCT

TCGAAluⅠDNA連接酶AGCTAGCTTCGATCGA平端連接AGCTTCGAAlu同聚物加尾連接同聚物加尾連接（四）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

?無(wú)性繁殖

?感受態(tài)細(xì)胞:容易接受外源DNA的狀態(tài).?方式:轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染（四）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

?無(wú)性繁殖導(dǎo)入大腸桿菌?導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞

1.氯化鈣轉(zhuǎn)化法

2.電擊法3.體外包裝感染法

?1.顯微注射法?2.電穿孔法3.DNA-磷酸鈣共沉淀?4.DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法5.病毒感染法?6.脂質(zhì)體介導(dǎo)法?7.細(xì)胞融合法8.原生質(zhì)體融合法9.微細(xì)胞介導(dǎo)法導(dǎo)入大腸桿菌（五）篩：篩選出含有重組體的受菌體

直接選擇法間接篩選法核酸水平蛋白質(zhì)水平

1.抗藥性選擇*1.酶切圖譜免疫學(xué)的技術(shù)：*2.核酸探針SDS、2.標(biāo)志補(bǔ)救*3.PCR

Westernblot、3.分子雜交法*4.序列測(cè)定ELISA、放免、免疫沉淀、熒光抗體等

（五）篩：篩選出含有重組體的受菌體

直接選擇法抗藥性選擇抗藥性選擇2）標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）

（LacZ基因）插入片段（LacZ基因失活）LacZ酶氨芐培養(yǎng)基2）標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）

（LacZ基因）插入片段(六)克隆基因的表達(dá)

原核表達(dá)體系——表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn)：

1.含有大腸桿菌適宜的選擇標(biāo)志

2.具有能調(diào)控轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生大量mRNA的強(qiáng)啟動(dòng)子

3.含有適當(dāng)?shù)姆g控制序列

4.含有合理設(shè)計(jì)的多接頭克隆位點(diǎn)真核表達(dá)體系關(guān)鍵步驟是將重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞(六)克隆基因的表達(dá)

質(zhì)粒噬菌體病毒PCRcDNA人工合成基因文庫(kù)限制性內(nèi)切酶有切口的載體有切口的目的基因DNA連接酶

重組體

轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染體外包裝帶重組體的宿主細(xì)胞

表型篩選電泳法核酸雜交免疫學(xué)方法目的基因的表達(dá)基因載體目的基因粘端連接平端連接尾接法分切接轉(zhuǎn)篩質(zhì)粒噬菌體病毒PCRcDNA人總觀總觀參考文章張亞旭DNA重組技術(shù)的研究綜述生物技術(shù)進(jìn)展2012年第2卷第一期57-83張洪淵生物化學(xué)教程第七章Page479王鏡巖朱圣庚徐長(zhǎng)法生物化學(xué)下冊(cè)第40章Page580百度百科馬克學(xué)席興宇轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染和感染的解析生物學(xué)教學(xué)2010（第35卷）第10期參考文章張亞旭DNA重組技術(shù)的研究綜述生物技術(shù)進(jìn)展2謝謝觀看謝謝觀看DNA重組技術(shù)的原理及步驟

第五組：鄭桂賢DNA重組技術(shù)的原理及步驟一、發(fā)展歷史1951年，美國(guó)學(xué)者E．萊德伯格等發(fā)現(xiàn)了噬菌體。1957年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了抗藥性質(zhì)粒。20世紀(jì)70年代初，生物化學(xué)研究的進(jìn)展也為重組DNA技術(shù)奠定了基礎(chǔ)1978年，諾貝爾生醫(yī)獎(jiǎng)?lì)C給發(fā)現(xiàn)DNA

限制酶的納森斯、亞伯與史密斯時(shí)，斯吉巴爾斯基在《基因》期刊中寫(xiě)道：限制酶將帶領(lǐng)我們進(jìn)入合成生物學(xué)的新時(shí)代?；蚬こ?、遺傳工程、分子克隆作為DNA重組技術(shù)的代名詞被廣泛使用。一、發(fā)展歷史1951年，美國(guó)學(xué)者E．萊德伯格等發(fā)現(xiàn)了噬菌體。二、DNA重組技術(shù)的原理1.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇與構(gòu)建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導(dǎo)入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達(dá)二、DNA重組技術(shù)的原理1.目的基因的獲取三、

DNA重組技術(shù)的步驟

1.分：分離目的基因

2.切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割

3.接：目的基因與載體連接

4.轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

5.篩：篩選出含有重組體的受菌體三、DNA重組技術(shù)的步驟RecombinantDNATechnology①?gòu)募?xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因⑦重組體的篩選RecombinantDNATechnology①?gòu)募?xì)胞（一）分：目的基因的獲取

1.化學(xué)合成法:較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物、測(cè)序引物、核酸雜交探針、定點(diǎn)突變

2.基因組DNA、cDNA3.聚合酶鏈反應(yīng)（一）分：目的基因的獲取

1.化學(xué)合成法:較短的基因（cDNA文庫(kù)基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA基因組DNA文庫(kù)限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝cDNA文庫(kù)基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA基因組DNA文庫(kù)克隆載體的選擇和構(gòu)建

理想載體具備的條件：可轉(zhuǎn)移性、復(fù)制功能、多克隆位點(diǎn)（廣泛、特異）、顯著的篩選標(biāo)志，便于篩選和鑒定、安全性常用克隆載體：質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA

質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子；具有自我復(fù)制功能；帶有抗性基因及表型識(shí)別等遺傳性標(biāo)記;經(jīng)改造后具有多克隆位點(diǎn)。pBR322是一個(gè)人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒，有萬(wàn)能質(zhì)粒之稱。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三個(gè)親本質(zhì)粒經(jīng)復(fù)雜的重組過(guò)程構(gòu)建而成的?？寺≥d體的選擇和構(gòu)建

理想載體具備的條件：可轉(zhuǎn)移性、復(fù)制功多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker質(zhì)粒載體多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker（二）切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割（二）切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割（1）與DNA分子相關(guān)的幾種酶及基因工程的其他工具

（1）與DNA分子相關(guān)的幾種酶及基因工程的其他工具

限制性內(nèi)切核酸酶

在特異位點(diǎn)上切割DNA分子分三類，常用為Ⅱ類酶識(shí)別序列呈回文對(duì)稱5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識(shí)別序列HaeⅠ的識(shí)別序列限制性內(nèi)切核酸酶

在特異位點(diǎn)上切割DNA分子5’-GAAT（三）接：目的基因與載體連接

(三)連接策略

1.粘端DNA間的連接

(1)同一限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)連接

(2)不同限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)連接

2.平端DNA間的連接

3.同聚物加尾連接

4.人工接頭連接（三）接：目的基因與載體連接

(三)連接策略粘端連接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA連接酶粘端連接CCGGCCGGGGC平端連接

AGCT

TCGAAluⅠDNA連接酶AGCTAGCTTCGATCGA平端連接AGCTTCGAAlu同聚物加尾連接同聚物加尾連接（四）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

?無(wú)性繁殖

?感受態(tài)細(xì)胞:容易接受外源DNA的狀態(tài).?方式:轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染（四）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

?無(wú)性繁殖導(dǎo)入大腸桿菌?導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞

1.氯化鈣轉(zhuǎn)化法

2.電擊法3.體外包裝感染法

?1.顯微注射法?2.電穿孔法3.DNA-磷酸鈣共沉淀?4.DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法5.病毒感染法?6.脂質(zhì)體介導(dǎo)法?7.細(xì)胞融合法8.原生質(zhì)體融合法9.微細(xì)胞介導(dǎo)法導(dǎo)入大腸桿菌（五）篩：篩選出含有重組體的受菌體

直接選擇法間接篩選法核酸水平蛋白質(zhì)水平

1.抗藥性選擇*1.酶切圖譜免疫學(xué)的技術(shù)：*2.核酸探針SDS、2.標(biāo)志補(bǔ)救*3.PCR

Westernblot、3.分子雜交法*4.序列測(cè)定ELISA、放免、免疫沉淀、熒光抗體等

（五）篩：篩選出含有重組體的受菌體

直接選擇法抗藥性選擇抗藥性選擇2）標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）

（LacZ基因）